Beyond Affinity: Drug-Kinase Interaction Put under the Microscope
Over the last 20 years, the consideration of biophysical parameters such as kinetics and thermodynamics has been used to guide modern drug design. In contrast to the classical approach that mainly relies on affinity optimization, biophysical parameters allow a further discrimination of potential dru...
Main Author: | |
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Contributors: | |
Format: | Doctoral Thesis |
Language: | English |
Published: |
Philipps-Universität Marburg
2017
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Subjects: | |
Online Access: | PDF Full Text |
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Seit rund 20 Jahren werden biophysikalische Parameter aus Thermodynamik und Kinetik immer häufiger verwendet, um die moderne Wirkstoffforschung zu verbessern. Im Gegensatz zum klassischen Wirkstoffdesign bei dem nach Affinitäten priorisiert wird, erlauben biophysikalische Methoden potentielle Wirkstoffkandidaten weitergehend zu differenzieren, auch wenn sie gleiche Affinitäten aufweisen. Leider werden mehr systematische Studien benötigt, die den Einfluss der chemischen Ligandstrukturen auf z.B. Thermodynamik untersuchen. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab diese bestehende Lücke zu verkleinern. In dieser Arbeit wird die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) als Modellprotein verwendet um Details über das Verhalten von Kinasen und der Thermodynamik bei der Ligandbindung zu untersuchen. Da Kinasen eine wichtige Rolle in verschiedensten Krankheiten spielen (z.B. Krebs), sind sie von höchster Wichtigkeit in der Wirkstoffentwicklung. Die Liganden die in dieser Studie verwendet werden sind von dem zugelassenen Wirkstoff Fasudil abgeleitet. Sie unterscheiden sich von Fasudil in ihrem Molekulargewicht, der Anzahl ihrer Freiheitsgrade oder durch zusätzliche kleinere Substituenten. Um die Relevanz von Liganden Freiheitsgraden auf die thermodynamischen Profile bei der Protein-Ligand Bindung zu untersuchen, wurden Kristallstrukturen dieser Komplexe bestimmt. Die Kristallstrukturanalyse bestätigte die bereits bekannte strukturelle Flexibilität der Proteinkinase. Insbesondere die Gly-reiche Schleife zeigt in allen Kristallstrukturen eine gesonderte räumliche Position. Die thermodynamischen Signaturen wurden mit Hilfe der isothermen Titrationskalorimetrie gemessen. Bemerkenswerterweise zeigt der Ligand mit den meisten intrinsischen Freiheitsgraden, die entropisch vorteilhafteste Bindung an PKA. Dieses kontraintuitive Ergebnis ist vermutlich auf eine höher geordnete lokale Wasserstruktur des Liganden vor der Bindung, in Lösung, zurückzuführen. Für die Serie, die auf Liganden mit zunehmendem Molekulargewicht fokussiert ist, konnten Unterschiede in der Koordination des Liganden mit dem Protein beobachtet werden. Dabei zeigte sich in den thermodynamischen Profilen ein klarer Trend, bei dem mit zunehmendem Molekulargewicht der entropische Bindungsbeitrag stieg, während der enthalpische Bindungsbeitrag sank. Der Grund hierfür ist vermutlich ebenfalls der Zustand des Liganden in Lösung, ein Faktor der leider häufig unbeachtet bleibt. Methylgruppen sind einfache Substituenten, die dennoch eine große Wirkung haben können. Bei der Untersuchung von Liganden mit zusätzlichen Methylgruppen in verschiedenen Positionen stellte sich heraus, dass diese nicht nur einen Einfluss auf die Affinität sondern auch auf die thermodynamischen Signaturen haben. Interessanterweise hat die Kombination von verschiedenen Methylgruppen keinen additiven Effekt, weder bezüglich der Thermodynamik noch bezüglich des Bindemodus in der Kristallstruktur. Andere Substituenten und Fragmente von Fasudil und Adenosintriphosphat (ATP) wurden kristallographisch auf ihre Interaktion mit der Scharnierregion der PKA untersucht. Die Scharnierregion ist der wichtigste Angriffspunkt für ATP-kompetitive Hemmstoffe. Kleinste Änderungen der chemischen Ligandstruktur führten zu starken Änderungen der Bindeposition und veränderten Interaktionen mit der Scharnierregion. Zur abschließenden Analyse wurde außerdem eine Kinase-Selektivitätsuntersuchung mit 39 Kinasen und 16 Liganden durchgeführt. Die so erhaltenen Selektivitätsprofile wurden dann auf eine mögliche Korrelation mit den thermodynamischen Daten hin überprüft. Für Kinaseinhibitoren ist eine hohe Selektivität einer der herausforderndsten und wichtigsten Parameter. Bei der Analyse zeigte sich, dass ausschließlich ΔG gut mit den Selektivitätsprofilen korreliert. Des Weiteren wird in der Arbeit noch eine Methodenuntersuchung diskutiert, bei der Cokristallisation mit der sogenannten „soaking“ (engl. Durchtränken) Methode verglichen wird. Dabei konnten signifikante Unterschiede zwischen den resultierenden Kristallstrukturen beobachtet werden. Dies weist darauf hin, dass Ergebnisse aus „soaking“ Experimenten idealerweise durch Cokristallisation bestätigt werden sollten. Der Bedarf an weiteren systematischen Studien, die das Zusammenspiel von Struktur, biophysikalischen Daten und Selektivitätsprofilen von Ligandenserien untersuchen, ist nach wie vor hoch. Solche Daten sind die notwendige Voraussetzung um die Abhängigkeiten dieser Parameter voneinander zu verstehen. Nur so können biophysikalische Parameter wirklich zielgerichtet und gewinnbringend eingesetzt werden um verlässliche Vorhersagen über die Auswahl von potentiellen Wirkstoffkandidaten zu treffen.