Biochemical and Molecular Investigations of Arabidopsis thaliana Transformed with Genes of Rosmarinic Acid Biosynthesis

Rosmarinsäure (RA) ist ein Ester von Kaffeesäure und 3,4-Dihydroxyphenylmilchsäure (DHPL). Dieser Naturstoff kommt in verschiedenen höheren Pflanzen und einigen niedrigeren Pflanzen vor. Allerdings ist das Vorkommen nicht konsistent, da nicht alle Mitglieder in jeder Taxonebene, in der RA gezeigt worden ist, RA enthalten. Neuere Untersuchungen bestätigen, dass einige Enzyme, die an der Bildung von RA beteiligt sind, in allen höheren Pflanzenarten vorhanden und auch in anderen Stoffwechselwegen aktiv sind. In Arabidopsis thaliana (Brassicaceae) wurde die Anwesenheit bestimmter RA-Biosynthese-Gene beschrieben, aber ein oder mehrere RA-spezifische Gene fehlen und somit ist die Pflanze nicht in der Lage, RA zu synthetisieren. Daher könnte das Einbringen der cDNA von CbRAS in Arabidopsis zeigen, ob Enzyme wie HPR2 (ein photorespiratorisches Enzym) und Cytochrom P450 Monooxygenasen aus der CYP98A-Familie (Enzyme bei der Bildung von Monolignolen) an der Bereitstellung der Substrate und der Bildung von RA oder RA-ähnlichen Estern beteiligt sein können. CbRAS-transformierte Arabidopsis thaliana wurden durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation gewonnen und erfolgreich als Zellsuspensionskulturen etabliert. Es wurden R-Linien (Pflanzen, die mit dem Vektor transformiert wurden, der cDNA von CbRAS enthielt) und L-Linien (Kontrollpflanzen, die mit dem leeren Vektor transformiert wurden) gewonnen. Die molekulare Charakterisierung zeigte, dass die T-DNA-Teile (RAS- und CaMV-35S-Promotorsequenzen) stabil in das Pflanzengenom integriert wurden. Die Anwesenheit des KanR-Gens (eines Nicht-T-DNA-Teils) in allen etablierten Zellsuspensionskulturen zeigte jedoch ein Phänomen, das auf die Integration der Nicht-T-DNA-Sequenzen des Vektors beruht. Dies wurde schon mehrfach in der Literatur beschrieben. Optimales Wachstum der Zellsuspensionskulturen, bestimmt anhand der Zellbiomasse und des Proteingehalts, wurde in der ersten Woche der Kultivierungsperiode beobachtet. Die Überexpression des RAS-Gens verringerte das Zellwachstum leicht, beeinträchtigte aber die Zellen nicht. Die starke Expression des RAS-Gens erhöhte nicht den Proteingehalt. Alle RA-Biosynthese-Enzyme hatten ihre höchste Aktivität während der logarithmischen Wachstumsphase. Enzyme wie TAT, C4H und 4CL erreichten ihre maximale Aktivität am 4. Tag, PAL und RAS am 6. Tag. Die Überexpression des RAS-Gens hatte keinen Einfluss auf die Aktivität der im RA-Biosyntheseweg vorgeschalteten Enzyme. Ihre Aktivitäten wurden als zelllinienspezifisch eingestuft. Die starke Expression des RAS-Gens führte nicht in allen ras-transformierten Linien zu einer messbaren RAS-Aktivität. Einige Linien hatten anfangs nachweisbare RAS-Aktivität, die jedoch mit zunehmender Passagenanzahl verloren ging. Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass posttranskriptionelles Gen Silencing (PTGS) nicht die Ursache hierfür war. Daher könnte eine komplexe Regulation auf der posttranslationalen Ebene beteiligt sein. Die RAS-Transkriptmenge variierte unter den ras-transformierten Linien. Dies könnte durch die Anzahl und die Stelle(n) von T-DNA-Integrationsereignissen oder zellulären Reaktionen der Zelllinien verursacht werden. Das Expressionsmuster anderer an der RA-Biosynthese beteiligter Gene lässt sich nicht klar zwischen ras-transformierten Linien, Kontrolllinien und dem Wildtyp unterscheiden. Im Allgemeinen sind die Transkriptlevel schwankend und linienspezifisch. Der Versuch, zwei Gene, CbHPPR und CbRAS, gleichzeitig in Arabidopsis zu überexprimieren, wurde durch die Erzeugung von „Hairy Root“ aus ras-transformierten Linien mit Hilfe von Agrobacterium rhizogenes erreicht, das das CbHPPR-Gen tragen. Es konnte nur eine einzige „Hairy Root“-Linie erhalten werden, die beide Gene überführte. Die transformierten Wurzeln zeigten jedoch weder RAS-Aktivität noch nachweisbare Mengen an ras-Transkript. Dies könnte durch PTGS-Ereignisse verursacht werden. Außerdem zeigten die transformierten Wurzeln keine signifikante Veränderung der HPPR-Aktivität, obwohl das HPPR-Gen stark exprimiert wurde. Dementsprechend bleibt der Versuch erfolglos, die Bildung von RAS-Esterprodukten durch doppelte Expression von hppr und ras zu erhöhen. Die phenolischen Inhaltsstoffe wurden über LC-MS analysiert. Hierbei zeigte sich, dass ras-transformierte Zellen mit hoher Wahrscheinlichkeit RA und Caf-pHPL akkumulierten, obwohl die Ausbeute extrem niedrig war. Dies ist ein Hinweis darauf, dass bei Anwesenheit von RAS in Arabidopsis thaliana HP(P)R eine doppelte Rolle im Primär- und Sekundärmetabolismus hat, indem sie Glycerat (in der Photorespiration) und pHPL (für die RA-Biosynthese) lieferte. Daraus ergeben sich neue Fragen in Bezug auf die Rolle von CYP98As in Arabidopsis, den Biosyntheseweg der RA und die Rolle der Vakuolen für die RA-Akkumulation. Dies sollte jedoch in zukünftigen Experimenten geklärt werden.