Development of a New Generation of Metal-Based Anticancer Drugs

Kinases are a large family of transferase enzymes, of which at least 538 different members are present in the human body.[11] By catalysing the transfer of the γ-phosphate group of ATP onto a specific side chain of their substrate, they mediate most cellular signal transductions in the body, ther...

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Main Author: Martin, Elisabeth Katharina
Contributors: Meggers, Eric (Prof.Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2017
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Table of Contents: Seit der Entdeckung der zentralen Rolle von Kinasen in der intrazellulären Signaltransduktion und der Entdeckung von Naturstoffen wie Staurosporin, die als unselektive Inhibitoren für Kinasen fungieren können, hat sich die Entwicklung von potenten Kinaseinhibitoren zu einem elementaren Teil der biologischen und medizinischen Forschung entwickelt. Während der letzten zwei Jahrzehnte hat die MEGGERS-Gruppe eine große Auswahl an selektiven und hoch-spezifischen ATP-kompetitiven Kinaseinhibitoren entwickelt, die auf inerten Koordinationskomplexen mit Metallzentren basieren, welche als strukturelles Templat zur Nachahmung des zuvor erwähnten Staurosporins dienen. Die generelle Struktur dieser Metallo-Pyridocarbazole ist in Abbildung 1 dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass diese Verbindungen sehr potent sind und oft selektiv Kinasen in Enzymassays, in Krebszelllinien in vitro und einfachen eukaryotischen Systemen in vivo inhibieren können. Dabei hat die Gruppe neue und innovative Chemotypen entwickelt, welche einen weitgehend unerforschten Bereich des chemischen Raums einnehmen, und kann damit die stark besiedelten urheberrechtlich geschützten Gebiete umgehen. Basierenden auf dieser Grundlage werden diese Verbindungen als potentielle Krebstherapeutika angesehen. Weiterführende Untersuchungen ihrer Eignung als potentielle Therapeutika, basierenden auf u.a. ihren pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften, wurden dabei in der Vergangenheit nicht verwirklicht. Daher beschäftigt sich diese Arbeit mit der Eignung dieser Verbindungsklasse als potentielle Krebstherapeutika. Dabei sollte die beste Verbindung identifiziert und als Leitstruktur zur Optimierung der benötigten Eigenschaften verwendet werden. Im ersten Ansatz wurden dabei, basierend auf der bereits bekannten Funktion als Kinase- bzw. ATPase-Inhibitoren und der damit inhärenten Eigenschaft als zielgerichtete molekulare Agenzien, die Verbindungen in einer Substanzbibliothek von 441 Verbindungen zusammengefasst und in einem klassischen empirischen Screening bezüglich ihrer Wirkung gegen Krebszellen in einem MTT-basierten Zytotoxizitätsassay in HT-29 Zellen getestet. Die dabei erfolgversprechendste Verbindung np829 (Abbildung 1), sowie attraktive synthetisierte Derivate, zeigten aber Toxizität, die vermutlich nicht alleine durch die Inhibition von Kinasen zu begründen ist. Daher wurden in einem zweiten Ansatz selektierte Verbindungen auf ihre Wirkstoffartigkeit in Bezug auf Löslichkeit, Permeabilität und metabolische Stabilität in Kollaboration mit den Novartis Institutes of BioMedical Research in vitro getestet. Zwei interessante stereoisomere Verbindungen wurden dabei selektiert und nach Bestätigung ihrer allgemeinen Stabilität, ihr pharmakokinetisches Verhalten über 7 bzw. 24 h in vivo in rodentia untersucht. Für den attraktivsten Kinaseinhibitor (RR97a (Abbildung 1) u.a. Inhibition der Kinase Pim1 im niedrigen nanomolaren Bereich) wurde zusätzlich die Organverteilung 7 h und 24 h nach intravenöser Gabe untersucht, und die Lunge als primäres Ziel der Verbindung identifiziert. Eine Ausscheidung des Zentralmetalls, vermutlich in Form des ursprünglichen Komplexes, über Urin und Kot wurde ebenfalls gezeigt, wobei diese über die betrachteten 24 h unvollständig war. Weiterhin wurden die Verbindungen in verschiedenen Krebszelllinien in vitro und in einem Hepatotoxizitätsassay ex vivo untersucht. Um diese Tests durchführen zu können, wurde zusätzlich der synthetische Zugang, sowie die Möglichkeit einer Hochskalierung des Syntheseansatzes untersucht. Abschließend wurden Derivate der interessanteren Verbindung dargestellt, um die Wirkstoffartigkeit weiter zu verbessern. Dabei konnte insbesondere die Löslichkeit erhöht werden, teilweise unter Erhalt oder Verbesserung der ursprünglichen Eigenschaften als Pim1 Kinaseinhibitor. Die Kombination der gewonnenen Erkenntnisse könnte dabei zukünftig genutzt werden, um die ADME-Eigenschaften der Leitstruktur oder anderer Pyridocarbazol-basierter Komplexe weiter zu optimieren. ADME ist dabei der Überbegriff für die Parameter Absorption, Distribution, Metabolismus und Eliminierung welche den Wirkstoff-Spiegel und die pharmakologische Aktivität einer Verbindung im Körper beeinflussen. The use of this type of inert metal complexes as kinase inhibitors has repeatedly been demonstrated in vitro.[151,162,166] In addition, some selected complexes have also been proven to successfully inhibit kinases in vivo in species of the chordate phylum.[121,149,171] This includes the in vivo inhibition of GSK- 3 in the development of xenopus laevis[149] and danio rerio embryos[121] by two different Ru-complexes (S-53 and R-61, see introduction for structures and more details), as well as the Flt4 inhibition related antiangiogenic properties in a xenotransplanted proangiogenic human cancer cell experiment in living zebrafish by an Ir-complex (62).[171] Based on these properties, and many more different kinase targets of the compound group, these inhibitors might be regarded as potential anti-cancer drugs. In addition to that, various ATPase inhibitors have been developed in the group, using the same concept. Further studies towards their suitability as potential therapeutic drugs concerning their ADME properties were however not conducted previous to this thesis. To address this issue, in a first approach it was attempted to find a suitable lead structure for ADME investigations by a classical empiric screening for cytotoxicity against cancer cells. This approach was chosen due to the fact that all complexes possess known kinase and ATPase inhibitory properties, thereby combining this classical approach with the appreciation of their activity as molecularly targeting agents. For that matter, a compound library with all available inhibitors was created, and all complexes (441 compounds), some only synthesised during the thesis, were tested in a single dose experiments in HT-29 human colorectal adenocarcinoma cells for their effect on cell viability via the MTT method. An exception were 33 compounds which were previously tested by ANJA LUDEWIG in HeLa human cervical cancer cells and deemed unsuitable. The most interesting compound from that screening (np829 (80b) Fig. 69), based on highest cytotoxicity, was additionally tested in different cancer cell lines in concentration dependent cytotoxicity assays resulting in LD50 values of 0.4 to 2.9 μM after 24 h incubation time. Its diastereomer (80a) showed cytotoxicity to a much lesser extent, indicating that the geometrical structure of 80b is important for its cytotoxicity and therefore its mode of action is probably based on kinase inhibition. To verify the exclusiveness of its structure, another 44 compounds with side chain modifications were tested, but np829 still remained as the most cytotoxic complex in HT-29 cells. However, the compound, as well as some of its derivatives, showed toxicity, which might not solely be explainable by kinase inhibition, as it seems to crystallise inside or on the surface of cells. Therefore, the approach was terminated in favour of another way to identify a suitable lead structure. As a second approach a focus was set on the drug-like abilities of this kind of kinase inhibitors, to move forward towards an application in cancer treatment. Therefore, selected compounds were tested for basic in vitro drug-like properties like solubility, permeability and metabolic stability towards CYP enzymes in rat liver microsomes in collaboration with the Novartis Institutes for BioMedical research (NIBR). Other interesting inhibitors were excluded from the study due to problems in MS quantification.