Regulation des anaeroben Abbaus aromatischer Kohlenwasserstoffe in Aromatoleum aromaticum EbN1

Das genomsequenzierte β-Proteobakterium Aromatoleum aromaticum Stamm EbN1 und einige verwandte Arten weisen die ungewöhnliche Stoffwechselaktivität des anaeroben Abbaus von Kohlenwasserstoffen sowie phenolischen Verbindungen auf. Hierfür besitzt A. aromaticum mehrere sehr substratspezifische Stoffwe...

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Main Author: Muhr, Enrico
Contributors: Heider, Johann (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2016
Subjects:
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Description
Summary:Das genomsequenzierte β-Proteobakterium Aromatoleum aromaticum Stamm EbN1 und einige verwandte Arten weisen die ungewöhnliche Stoffwechselaktivität des anaeroben Abbaus von Kohlenwasserstoffen sowie phenolischen Verbindungen auf. Hierfür besitzt A. aromaticum mehrere sehr substratspezifische Stoffwechselwege. Trotz der starken chemischen Ähnlichkeit einiger Verbindungen, erfolgt die spezifische Induktion der katabolischen Enzyme ausschließlich in Anwesenheit des jeweiligen Substrates und nicht durch chemisch analoge Verbindungen. Mittelpunkt dieses Promotionsprojektes war der Mechanismus der spezifischen Sensierung von Kohlenwasserstoffen und phenolischen Substraten, sowie die Regulation der Induktion der jeweiligen Abbauwege. Durch die Kombination aus neu entwickelten und bereits etablierten biochemischen und molekularbiologischen Methoden, wurde eindeutig gezeigt, dass Ethylbenzol und p-Ethylphenol, trotz ihrer starken chemischen Ähnlichkeit, durch zwei vollständig getrennte Abbauwege mit spezifisch induzierten Enzymen metabolisiert werden. Hierfür wurden Kulturen des Stammes EbN1 unter denitrifizierenden Bedingungen neben Ethylbenzol und p-Ethylphenol auch auf Acetophenon, einem wichtigen Zwischenprodukt des anaeroben Ethylbenzolstoffwechsels, kultiviert. Die Messung der Aktivitäten aller beteiligten Enzyme, der Häm-Färbungen sowie der Immun- und Biotin-Blot-Analysen ermöglichten die Identifizierung und Differenzierung der Enzyme der beiden anaeroben Abbauwege. Weiterhin wurden Lücken des postulierten p-Ethylphenolabbauweges durch neu identifizierte Enzyme geschlossen. Zu den identifizierten Enzymen gehörte unter anderem eine Biotin-abhängige p-Hydroxyacetophenon-Carboxylase. Das aromatische Keton Acetophenon, Intermediat des anaeroben Ethylbenzolabbaus, kann durch A. aromaticum sowohl unter anaeroben als auch aeroben Bedingungen über eine ATP-abhängige Acetophenon-Carboxylase (ApcABCDE) metabolisiert werden. Um die Bedingungen genauer zu analysieren, unter denen das apc-bal Operon exprimiert ist, wurde ein Reporterstamm mit einem fluoreszierenden mCherry-Protein konstruiert. Dieser bildete die Grundlage für die Entwicklung eines spezifischen Acetophenon Bioreportersystems. Zu diesem Zweck, wurde eine Fusion des mCherry Gens mit dem ersten Gen des Operons (apcA) erstellt und in das Chromosom von A. aromaticum integriert. Die Expression dieses Fusionsproteins sowie dessen Fluoreszenzaktivität entsprach dem Expressionsmuster der Enzyme des Acetophenonmetabolismus. Zum anderen wurde nachgewiesen, dass die zugesetzte Acetophenonkonzentration, in einem Bereich von 25 bis 250 μM, proportional zur produzierten Menge an ApcA-mCherry war. Mit Ausnahme der beiden 1-Phenylethanol Enantiomere, welche von A. aromaticum leicht zu Acetophenon umgesetzt werden können, zeigten alle getesteten chemisch analogen Verbindungen keine oder deutlich schwächere Signale. Ein weiterer Teil dieser Dissertation betraf die Analyse des adiRS Operons, das für ein Zweikomponenten-Regulationssystem (TCS) kodiert, welches wahrscheinlich die Acetophenon-abhängige Induktion des apc-bal Operons in A. aromaticum reguliert. Hierfür wurde durch homologe Rekombination eine Chloramphenicol-resistente Mutante konstruiert, bei der die adiRS Gene deletiert wurden. Entgegen den Erwartungen wuchs die adiRS Deletionsmutante noch immer mit Acetophenon und Ethylbenzol. Allerdings wurden reduzierte Acetophenon-Carboxylase-Aktivitäten in Extrakten dieser Kulturen nachgewiesen. Überraschenderweise zeigte die Mutante zudem ungewöhnliche Induktionsmuster der EbDH und zwei paraloger Biotin-Carboxyl-Carrier-Proteine (XccB und XccB2), welche in Acetophenon- bzw. Ethylbenzol-abbauenden Zellen des Wildtyp-Stammes nicht induziert sind. Die Komplementation der adiRS Gene auf einem Plasmid führte nur zu einem teilweisen Ausgleich der beobachteten Abweichungen und nicht zum Phänotyp des Wildtyps. Weiterhin wurde das bereits beschriebene apcA-mCherry Reporterkonstrukt in das Chromosom der Deletionsmutante integriert. Die ermittelten Ergebnisse gaben Indizien für eine zeitverzögerte und verminderte Expression der apcA-mCherry Fusion, wenn die adiRS Gene deletiert waren. Die erhaltenen Daten sind konsistent mit der Annahme, dass die Acetophenon-abhängige Induktion des apc-bal Operons neben dem AdiRS-System möglicherweise durch ein zweites parallel wirkendes TCS beeinflusst wird. Ein möglicher Kandidat sind die xdiRS Genprodukte, welche hohe Ähnlichkeit zu AdiRS aufweisen. Abschließend wird ein vorläufiges Modell zur potentiellen Rolle der beiden TCS AdiRS und XdiRS in der Substraterkennung und -unterscheidung in A. aromaticum Stamm EbN1 vorgestellt. Schließlich wurden in dieser Arbeit mit Hilfe von Primer-Extension-Analysen erstmals putative Transkriptionsstartpunkte für die am anaeroben Ethylbenzol- und Acetophenonabbau beteiligten Operons experimentell ermittelt. Den identifizierten Startpunkten, wurden durch den Vergleich mit Konsensussequenzen σ70-abhängiger Promotoren putative -35 und -10 Regionen zugeordnet. Im Falle des apc-bal Operons könnten der umfangreiche 5‘-untranslatierte Bereich und die vorhergesagte Sekundärstruktur mit einer berechneten minimalen freien Energie von -61,4 kcal mol-1 ein Indiz dafür sein, dass diese RNA-Struktur an der transkriptionellen oder translationellen Regulation beteiligt ist.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2016.0806