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Überprüfung des Drug Delivery Konzepts von „Lipid-Nucleosid- und Polysaccharid-Konjugaten von 5-Fluorouracil“
2012 standen maligne Erkrankungen an zweiter Stelle der Todesursachenstatistik in Deutschland (Becker & Holzmeier 2012). Einen wichtigen Baustein in der Therapie der malignen Erkrankungen stellt die Chemotherapie dar. Trotz großer Fortschritte in den vergangenen Jahren konnte nur eine geringe Ve...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2016
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | 2012 standen maligne Erkrankungen an zweiter Stelle der Todesursachenstatistik in Deutschland (Becker & Holzmeier 2012). Einen wichtigen Baustein in der Therapie der malignen Erkrankungen stellt die Chemotherapie dar. Trotz großer Fortschritte in den vergangenen Jahren konnte nur eine geringe Verbesserung des Überlebens der Patienten erzielt werden (Bourret et al. 1979, Krook et al. 1991).
Das Uracil-Analogon 5-Fluorouracil (5-FU) ist ein Antimetabolit, der weit verbreitet in der Chemotherapie maligner Tumoren Anwendung findet (Bodner-Adler et al. 2007, Carrato 2008, Khosravi Shahi et al. 2007, Kish et al. 1994, Zhao et al. 2013). Eines der größten Handicaps von Chemotherapeutika, wie 5-FU, ist die insuffiziente Penetration der Zellmembran, die durch eine hohe Hydrophilie bedingt ist (Malecki et al. 2013a). Daher haben Prof. Dr. Rosemeyer und Frau Dr. Malecki im Rahmen eines Kooperationsprojekts (Prof. Rosemeyer, Osnabrück/Prof. Kinscherf, Marburg) verschiedene Derivate von 5-Fluorouridine (5-FUrd, 2a) entwickelt, welche lipophile Reste in N(3)- und/oder in 2‘3‘-O-Position tragen (3a-7a, 3c, 2c, 3b-7b), mit dem Ziel durch erhöhte Lipophilie der Derivate eine verbesserte Penetration und eine geringere Rate an Nebenwirkungen zu erreichen (Köstler et al 2013, Malecki et al. 2013a, Malecki et al. 2013b, Malecki et al. 2014, Malecki & Rosemeyer 2010, Rosemeyer et al. 2012, Rosemeyer & Malecki 2012, Werz et al. 2013). Zusätzlich wurde zum Vergleich das 2‘3‘-O-Nonadecylidene Derivat von Uridin, 3c, hergestellt (Köstler et al. 2013).
In dieser Dissertation erfolgte die in vitro-Testung des Drug Delivery Konzeptes der „Lipid-Nucleosid- und Polysaccharid-Konjugate von 5-FU (2a, 3a-7a, 3c, 2c, 3b-7b)“ an den Krebszelllinien HT-29 (humanes Kolonkarzinom), HepG2 (humanes hepatozelluläres Karzinom), sowie RENCA (murine Nierenzellkarzinom) und an Zellen des Immunsystems, d.h. differenzierten, humanen Makrophagen (THP-1).
Um die Frage zu klären, ob die Substanzen die Zellmembran passieren können, und in welchem Zellkompartiment sie danach lokalisiert sind, wurden HT-29-Zellen mit ATTO 245®-konjugierten Test-Substanzen (2c, 3b-7b) für 24 h inkubiert. Alle Derivate passierten die Zellmembran und akkumulierten im Zytoplasma, unter Aussparung des Zellkerns. Nur das Derivat 2c zeigte eine granulierte Verteilung im Zytoplasma.
Ein Schwerpunkt dieser Dissertation war es, den Einfluss der Aufnahme der Testsubstanzen (3a-7a, 3c) auf die Proliferation und Apoptose der Zellen und die zytostatische/zytotoxische Aktivität der Derivate im Vergleich zu 5-FU (1) und 5-FUrd (2a) zu untersuchen.
Nach 24 h, 48 h bzw. 72 h Inkubation der humanen Kolonkarzinomzellinie HT-29 mit den Derivaten 1 (5-FU) (14-23%, 35-46%, bzw. 30-58%) und 2a (5-FUrd) (33-45%, 60-67%, bzw. 58-67%) konnte im Vergleich zur Negativkontrolle eine signifikante Reduktion der Viabilität der Zellen beobachtet werden. Nach 24 h Inkubation der HT-29-Zellen zeigten in den Konzentrationen 40 µM und 80 µM die Derivate 3a (77% und 95%), 5a (30% und 86%) und 3c (89% und 96%) eine signifikante Abnahme der Viabilität im Vergleich zur Negativkontrolle. Diese drei Derivate zeigten nach 24 h Inkubation in den Konzentrationen 40 µM und 80 µM ebenfalls im Vergleich zur Positivkontrolle (1) eine signifikante Abnahme der Viabilität der HT-29-Zellen (61-81%, 73% bzw. 80-82%). Nach 48 h Inkubation der HT-29-Zellen mit den Derivaten konnte bei vier Derivaten in den Konzentrationen 40 µM und 80 µM eine signifikante Abnahme der Viabilität im Vergleich zu 5-FU (~Positivkontrolle) beobachtet werden: 3a (9-54%), 5a (5-48%), 7a (2-30%) und 3c (53-63%). Die Derivate 4a und 6a zeigten keinen Effekt auf die Viabilität der HT-29-Zellen.
Die Derivate 3a, 5a, 7a und 3c zeigten auch bei anderen Krebszelllinien (RENCA und HepG2) eine signifikante Abnahme der Viabilität: Nach 48 h Inkubation der RENCA-Zelllinie mit den Derivaten, zeigten die Derivate 3a (51-57%) und 5a (56%) eine signifikante Abnahme der Viabilität im Vergleich zu 5-FU. Die Derivate 3c (38-49%) und 7a (25-44%) wiesen bei RENCA-Zellen ähnliche zytostatische Effekte auf, wie die Substanzen 1 (29-48%) und 2a (41-46%). Nach 48 h Inkubation der HepG2-Zelllinie mit den Derivaten konnte bei den Derivaten 3a (72-75%),5a (53%), 7a (43%) und 3c (22-74%) eine signifikante Abnahme der Viabilität im Vergleich zu 5-FU beobachtet werden.
Von besonderem Interesse war das Ergebnis der Testung der Derivate an differenzierten THP-1-Makrophagen, um zwischen zytotoxischen Effekten und Nebenwirkungen unterscheiden zu können. Das Derivat 5a zeigte nach 48 h Inkubation eine signifikant um 6-27% erhöhte Zunahme der Viabilität im Vergleich zu 5-FU (~Positivkontrolle).
Die mit ATTO 425®-konjugierten 5-Fluorouridinderivate 3b, 4b, 5b, 6b und 7b wurden bzgl. ihrer Effekte auf die Viabilität der HT-29-Kolonkarzinomzellen getestet, nach 24 h und nach 48 h Inkubationszeit. Die mit ATTO 425®-konjugierten 5-FUrd Derivate zeigten in allen getesteten Konzentrationen (10-80 µM) im Vergleich zur Kontrolle keine Unterschiede bzgl. Viabilität der Zellen. Nur das mit ATTO 425®-konjugierte 5-FUrd (2c) zeigte in den Konzentrationen 10-80 µM im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Abnahme der Viabilität der HT-29-Zellen um 31-52% bzw. 41-57%.
Zusätzlich testeten wir den Einfluss der Derivate auf die Induktion der Apoptose und Proliferation im Vergleich zu 5-FU (1) und 5-FUrd (2a) bei HT-29-Zellen nach 1 h, 2 h, 4 h und 6 h Inkubationszeit. Das Derivat 5a zeigte signifikante Zunahmen der Apoptose bei 80 µM nach 2 h Inkubationszeit (um das 3,1-Fache), nach 4 h (um das 3-Fache) bzw. 6 h (um das 4-Fache). Nach 6 h Inkubation konnte bei 5a auch bei 40 µM eine signifikante Zunahme der Apoptose um das 3,3-Fache beobachtet werden.
Des Weiteren wurde die Gensignatur (zur Testung der Signaltransduktion) der HT-29-Zellen nach Behandlung mit diesen Substanzen untersucht. In der Real-time PCR (qRT-PCR) zeigte das Derivat 5a bei 40 µM eine signifikante Zunahme der Expression des Tumorsuppressorgens p53 um das 2-Fache im Vergleich zur Negativ- und Positivkontrolle (5-FU), sowie eine 1,8-fache Zunahme der Expression des proapoptotischen Caspase 3 Gens.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei mehreren Krebszelllinien einige Derivate von 5-FUrd (2a) effektiver in ihrer Zytotoxizität sind, als 5-FU (1) oder 5-FUrd (2a). Besonders das Derivat 5a ist von großem Interesse, da es trotz der hohen zytotoxischen Aktivität bei Krebszelllinien, keine zytotoxischen Effekte bei differenzierten Makrophagen (~Immunzellen) zeigt. Das Derivat 5a könnte somit ein neuartiges, zytotoxisches, multipotentes Chemotherapeutikum darstellen.
Zur abschließenden Beurteilung des pharmakologischen/therapeutischen Potentials sind allerdings weitere Untersuchungen, z. B. an Mikrotumoren/-sphären, sowie tierexperimentelle und prospektive klinische Studien notwendig. |
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| Umfang: | 112 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2016.0544 |