Pan-archaeal analysis of C/D box sRNA biogenesis and methylation targets

Posttranskriptionale Modifikationen sind in RNA Molekülen von allen drei Domänen des Lebens zu finden und sie beeinflussen die Stabilität und Funktionalität der RNAs. Die häufigsten Modifikationen sind 2'-O-Methylierungen der Ribose oder Pseudouridylierungen. In Archaeen kommen sie am häufigsten in ribosomalen RNAs (rRNAs) und Transfer-RNAs (tRNAs) vor. Die Position in der diese Modifikationen eingefügt werden, wird durch kleine RNAs bestimmt die an einen Ribonukleoproteinkomplex (RNP) gebunden sind. Für die Positionsbestimmung der 2'-O-Methylierungen in den Ziel-RNAs sind in Archaeen C/D box sRNAs zuständig. Charakteristische Sequenzmotive der C/D box sRNAs sind die BoxC/C' (Konsensussequenz: RUGAUGA) und BoxD/D' (Konsensussequenz: CUGA). Während der C/D box sRNA Faltung bilden diese Motive Basenpaare (BoxC mit BoxD sowie BoxC' mit BoxD') und dadurch entstehen zwei Kink-turn Motive, die durch die Bindung von L7Ae stabilisiert werden. Die Sequenzen zwischen den BoxC und BoxD' bzw. BoxC' und BoxD Motiven weisen Komplementarität zu den Sequenzen der Ziel-RNA auf und dadurch bestimmen sie das Ribonukleotid an dem die Ribose 2'-O-methyliert wird. Das Ribonukleotid der Ziel-RNA, das komplementär zum fünften Ribonukleotid stromaufwärts der BoxD/D' Motive ist, wird durch die Methyltransferase Fibrillarin modifiziert. Basierend auf den zur Ziel-RNA komplementären Bereichen, wurden die C/D box sRNA Ziele von sieben Archaeen vorhergesagt und in den Konsensusstrukturen der 16S und 23S rRNA gekennzeichnet. Konservierte Methylierungshotspots wurden in evolutionär ursprünglichen Kernregionen der rRNAs gefunden, die wichtig für den Ribosomenaufbau und die Ribosomenfunktionalität sind und nicht von ribosomalen Proteinen geschützt werden. Deshalb könnten die Modifikationen zur Faltung, Stabilisierung von Sekundärstrukturen sowie der Funktion der rRNA beitragen. In Archaeen ist die Biogenese der C/D box sRNAs weitgehend unbekannt, da für die Mehrheit der C/D box sRNA Gene keine eigenen Promotoren identifiziert werden konnten. Die Analyse des genomischen Kontexts von C/D box sRNA Genen in diversen Archaeen hat gezeigt, dass dieser sehr unterschiedlich sein kann. Es wurden verschiedene C/D box sRNA Gen Lokalisierungen gefunden, bei denen die Transkription ohne das Vorhandensein eines eigenen Promotors möglich ist. Es konnten z.B. C/D box sRNA Gene identifiziert werden die in 5' oder 3'-UTRs von flankierenden protein-codierenden Bereichen liegen sowie Cluster von mehreren C/D box sRNA Genen, die polycistronisch transkribiert werden. Um die C/D box sRNA Stabilisierungs- und Reifungs-Voraussetzungen zu identifizieren, wurden Plasmid-basierte in vivo Analysen in Sulfolobus acidocaldarius durchgeführt, wobei C/D box sRNA Gen Varianten mit den nativen oder beliebigen stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Sequenzen genutzt wurden. Die Analysen haben gezeigt, dass die Reifung der C/D box sRNAs unabhängig von den stromaufwärts oder stromabwärts gelegenen Sequenzen ist. Die Integrität des k-turns ist wichtig für die C/D box sRNA Stabilität. C/D box sRNAs weisen eine transkriptionale Plastizität auf und die Reifung der RNAs scheint die Aktivität von unspezifischen Exoribonukleasen einzuschließen. Die vollständige Degradation der C/D box sRNAs könnte durch die co-transkriptionale Assemblierung von L7Ae oder des kompletten C/D box sRNPs verhindert werden. In verschiedenen hyperthermophilen Archaeen kommen zudem zirkuläre Formen der C/D box sRNAs vor, die wahrscheinlich einen Schutz vor Degradation darstellen. Es konnte gezeigt werden, dass die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Sequenzen der C/D box sRNA Gene für die Zirkularisierung nicht relevant sind, allerdings muss die für die Zirkularisierung zuständige Ligase noch identifiziert werden. Somit liefert diese Arbeit Einblicke in die Transkription und Reifung von C/D box sRNAs in Archaeen und zeigt, dass konservierte 2'-O-Methylierungsmuster in rRNAs von Archaeen existieren.