The serine/threonine protein kinase SGK3 stimulates endosomal recycling of the potassium channel Kir2.2.

Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 (SGK3) increases the expression of various membrane proteins at the cell surface. In this study, the mechanism by which SGK3 increases the surface expression of the potassium channel Kir2.2 was investigated using two-electrode voltage clamp, luminometric...

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Main Author: Grothus, Katrin
Contributors: Daut, Jürgen (Prof. Dr. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2015
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Die Serum- und Glucocorticoid-induzierbare Kinase 3 (SGK3) erhöht die Oberflächenexpression zahlreicher Membranproteine. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus, durch den SGK3 die Oberflächenexpression des Kaliumkanals Kir2.2 erhöht, in Xenopus laevis Oozyten und einer Säugerzelllinie (COS-7) untersucht. Dazu wurden die Zwei-Elektroden-Spannungsklemme, luminometrische Oberflächen-Assays und Fluoreszenz-mikroskopie eingesetzt. Eine Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen, durch die SGK3 die Oberflächenexpression von verschiedenen Membranproteinen und Transportern erhöht, wurde bereits beschrieben. Darunter die Phosphorylierung der Ubiquitin-Ligase Nedd4-2, die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors FOXO3a und die Phosphorylierung der Phosphoinositid-Kinase PIKfyve. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass keiner dieser Mechanismen für die erhöhte Anzahl von Kir2.2-Kanälen in der Membran verantwortlich ist. Sie lassen weiterhin den Schluss zu, dass SGK3 weder einen Effekt auf die Anzahl der endozytierten Kir2.2-Kanäle, noch auf die Anzahl der neu synthetisierten Moleküle hat. Mit einem auf Antikörpern basierenden Recycling-Assay konnte gezeigt werden, dass ein Großteil der Kanäle während zweier dreißigminütiger Inkubationszeiten internalisiert und anschließend zurück an die Zellmembran transportiert wurde. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Ko-Expression einer konstitutiv aktiven SGK3-Mutante im Vergleich zu der Ko-Expression einer dominant-negativen Mutante zu einer erhöhten Anzahl von recycelten Kir2.2 Kanälen führte. Fluoreszenzmikroskopie-Aufnahmen mit lebenden COS-7 Zellen und zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen zeigten, dass der Kaliumkanal Kir2.2, die Kinase SGK3 und das kleine G-Protein Rab7 in hohem Maße in PI(3)P positiven, endosomalen Kompartimenten kolokalisiert waren. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass eine SGK3-Mutanten, die nicht mehr in der Lage ist an PI(3)P zu binden, einen deutlich geringeren Effekt auf die Oberflächenexpression von Kir2.2 hat, als die Wildtyp-Kinase. Diese Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass die intrazelluläre Lokalisation von SGK3 an endosomalen Membranen eine wichtige Rolle für ihren Effekt auf Kir2.2 spielt. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse darauf hinweisen, dass SGK3 das Recycling von Kir2.2-Kanälen aus einem PI(3)P und Rab7 positiven Kompartiment stimuliert. Bei diesem Kompartiment handelt es sich um ein Zwischenstadium im Reifungsprozess von frühen zu späten Endosomen. Während des Recyclings zurück an die Zellmembrane werden die Kanäle wahrscheinlich durch das Rab11-positive Recycling Endosom geschleust.