Etablierung eines NSCLC-Modells zur Untersuchung der Rolle der p53 DNA Bindungskooperativität für Zellschicksalsentscheidungen in vitro und in vivo

Der Tumorsuppressor p53 fungiert als eine zelluläre Drehschreibe, die eine Vielzahl von Stresssignalen erkennt und weiterverarbeitet. Über eine enge Kontrolle des Zellzyklus und des Zustands des Genoms sichert p53 die genomische Integrität einer Zelle und entscheidet durch seine Funktion als Transkr...

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Main Author: Kahnis, Robert Walter
Contributors: Stiewe, Thorsten (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2015
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Der Tumorsuppressor p53 fungiert als eine zelluläre Drehschreibe, die eine Vielzahl von Stresssignalen erkennt und weiterverarbeitet. Über eine enge Kontrolle des Zellzyklus und des Zustands des Genoms sichert p53 die genomische Integrität einer Zelle und entscheidet durch seine Funktion als Transkriptionsfaktor als Antwort auf zelluläre Stressoren über das Zellschicksal. Abhängig von Art und Ausmaß des Schadens, kann die Antwort von transientem Zellzyklusarrest mit Einleitung von DNA-Reparaturprogrammen über einen irreversiblen Zellzyklusstopp durch Seneszenz oder Differenzierung bis hin zur Entfernung der Zelle aus dem Organismus durch p53-vermittelte Apoptose reichen. Für die Auswahl von Zielgenen und damit das p53-abhängige Zellschicksal spielt die p53 DNA Bindungskooperativität eine entscheidende Rolle. p53 bindet als Tetramer kooperativ an die DNA. Die strukturelle Basis hierfür stellen intermolekulare Interaktionen zwischen den beiden gegensätzlich geladenen Aminosäureresten Glutamat 180 und Arginin 181 an der Helix H1 der DNA Bindungsdomänen von jeweils zwei p53 Monomeren dar. Mutationen an dieser Stelle können die Kooperativität und damit Bindungsaffinität von p53 an die DNA verringern bzw. erhöhen. Dies beeinflusst die Zielgenselektion, denn hohe Kooperativität erweitert das Zielgenspektrum auch auf Gene mit von der p53-Konsensussequenz abweichenden p53-responsiven Elementen. Während Zielgene, die in der Auslösung von Zellzyklusarrest involviert sind, meist kanonische p53 RE aufweisen und daher sowohl von niedrig- als auch hoch-kooperativem p53 transaktiviert werden können, finden sich in den Promotoren von Apoptose-fördernden Zielgenen weniger perfekte, niedrig-affine p53 Bindungsstellen, für deren Bindung daher hohe Kooperativität erforderlich ist. Der Einfluss der Bindungskooperativität auf das langfristige Proliferationsverhalten von Tumorzellen in vitro und in vivo konnte dabei bislang noch nicht vergleichend untersucht werden. Übergeordnetes Ziel dieser Arbeit war es daher, Zelllinien mit stabiler Expression von p53-Kooperativitätsmutanten zu etablieren, welche den Einfluss von Kooperativität auf das Zellschicksal abbilden und untersuchbar machen. Hierzu wurde ein induzierbares p53-Expressionssystem mit den verschiedenen Kooperativitätsmutanten kloniert, die das ganze Spektrum der H1-Helix-Interaktionsstärken – von aufgehoben bis über dem physiologischen Niveau liegend – abdecken. Das System wurde weiterhin mit einem Reporter versehen, um die p53 Expression überwachbar zu machen. Die entstehenden Fusionsproteine wurden korrekt exprimiert und übten erst nach Aktivierung p53-spezifische Effekte aus. Um eine optimale Vergleichbarkeit des Einflusses von Kooperativität auf das Zellschicksal herzustellen, wurde der Versuch unternommen, die p53 Konstrukte Endonuklease-vermittelt zielgerichtet in den Rag1 Genlokus p53-negativer H1299 Zellen zu integrieren. Dabei wird der zelluläre Reparaturmechanismus der homologen Rekombination ausgenutzt, um isogene Zelllinen zu generieren. Es zeigte sich eine sehr geringe Rekombinationsrate; zudem wiesen die positiv getesteten Klone unterschiedlich hohe p53-Proteinlevel und weiterhin keine induzierbare und effektive Aktivität von p53 auf. Daher eigneten sie sich nicht zur weiteren Untersuchung der Bindungskooperativität. Es lässt sich diskutieren, dass aufgrund verschiedener möglicher Gründe – z.B. dem epigenetischen Status des Rag1-Lokus oder Mutationen im DNA-Reparatursystem – Meganuklease-vermittelte zielgerichtete Integration in H1299 Zellen nur mit sehr geringer Effizienz möglich ist. Daraufhin wurden durch konventionelle Transfektion und Selektion Zelllinien mit stabiler Expression der p53-Fusionsproteine generiert. Diese zeigten eine gute Expression der Konstrukte und nach Aktivierung von p53 starke, p53- und kooperativitätsabhängige Effekte. So zeigte sich bei der Untersuchung der langfristigen Auswirkung der Kooperativität auf die Proliferation eine mit steigender Kooperativität reduzierte Proliferationskinetik. Da die Zellen nicht isogen zueinander waren, zeigte sich in manchen der verwendeten Klone ein Einfluss der unterschiedlichen Proteinlevel auf das Zellschicksal, welche teilweise den Einfluss der Bindungskooperativität maskierte. Andererseits konnte aber auch verdeutlicht werden, dass dieses Modell bei sorgsamer Auswahl der Klone den Einfluss der p53 DNA Bindungskooperativität sehr gut abbilden kann. Daher eignet es sich sehr für weitere Experimente. Die Mechanismen p53-vermittelter Zellschicksalsentscheidungen zu verstehen, ist von großer Bedeutung, weshalb die weitere Erforschung der Bindungskooperativität – als ein Modulator dieser Entscheidungen – vorangetrieben werden sollte. Als eine der Möglichkeiten für weitere Untersuchungen mit diesem Modell bieten sich Xenograft-Studien an.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2015.0176