Activity-dependent regulation of miRNAs in different subcellular compartments of neurons and its implications for neuronal morphogenesis and plasticity

Die aktivitätsabhängige sowie räumlich-zeitlich koordinierte Regulation der Genexpression in Neuronen ist essentiell für die Bildung und Funktion neuronaler Schaltkreise im Gehirn. Vor kurzem wurden microRNAs, eine neue Klasse posttranskriptionaler Regulatoren der Genexpression, mit der Regulation neuronaler Differenzierung und Entwicklung in Verbindung gebracht. Des Weiteren konnte in reifen, voll entwickelten Neuronen gezeigt werden, dass miRNAs (z.B. miR-134) in der Kontrolle lokaler dendritischer Proteinsynthese in der Nähe von Dornfortsätzen involviert sind (Schratt et al., 2006). Diese aktivitätsabhängige lokale Proteinsynthese ist notwendig für synaptische Plastizität, welche als molekulare Grundlage von Lernen und Gedächtnis angesehen wird. Die molekularen Mechanismen, welche der Funktion und Regulation von miRNAs während synaptischer Plastizitätsvorgänge zugrunde liegen, sind jedoch noch weitestgehend unbekannt. In einer früheren Publikation unseres Labors wurde gezeigt, dass die Aktivität der im Gehirn angereicherten miRNA miR-134 durch den Wachstumsfaktor BDNF reguliert wird (Schratt et al, 2006), welcher im Rahmen synaptischer Stimulation in Neuronen freigesetzt wird. Interessanterweise ist diese miRNA im Mausgenom in einem großen miRNA Cluster (miR379-410 Cluster) kodiert, das aus insgesamt 39 miRNAs besteht. Die Expression des miR379-410 Clusters wird durch neuronale Aktivität mittels des Transkriptionsfaktors MEF2 induziert, welcher an eine dem Cluster vorgeschaltete regulatorische Region bindet (Fiore et al., 2009). Die transkriptionelle Hochregulierung einer Reihe von miRNAs des miR379-410 Clusters (miR-134, -381 and -329) ist notwendig für die aktivitätsabhängige Dendritenentwicklung in hippocampalen Rattenneuronen. Des Weiteren zeigte sich, dass die posttranskriptionale Regulation des RNA-Bindeproteins Pumilio2 durch miR-134 essentiell für aktivitätsabhängige Dendritogenese ist. Zusammenfassend haben wir einen neuen MEF2-miRNA-PUM2 Signalweg identifiziert, der an der aktivitätsabhängigen Regulation der Dendritogenese in Primärneuronen beteiligt ist. MiR-134 ist in Dendriten hippocampaler Neuronen lokalisiert, wo sie die lokale Translation von Proteinen regulieren kann, die für die Struktur und Plastizität von Dornfortsätzen wichtig sind. Zu Beginn dieses Projekts war jedoch nicht bekannt, wie diese miRNA gezielt in Dendriten gelangt. Ich war an einem Projekt beteiligt, welches zum Ziel hatte, die Transportmechanismen von miR-134 in Dendriten zu zu charakterisieren. Wir konnten zeigen, dass die dendritische miR-134 Lokalisierung von der DEAH-box Helikase DHX36 vermittelt wird, welche an ein Cis-Element in der Loopregion des miR-134 Vorläufers (pre-miR-134) bindet (Bicker et al., 2013). Darüber hinaus beobachteten wir, dass Verlust von DHX36 zu erhöhten Proteinmengen von LIMK1 führt, einem dendritisch lokalisierten Zielgen von miR-134 (Schratt et al, 2006). Zusammenfassend haben wir einen neuen Mechanismus der dendritischen Lokalisierung von pre-miR-134 beschrieben, der relevant ist für die Funktion von miR-134 in der Morphogenese dendritischer Dornfortsätze. Die aktivitätsabhängige Regulation der Genexpression im Zellkern spielt eine wichtige Rolle für die Entwicklung und Funktion des Nervensystems, wie etwa für synaptische Plastizität und Gedächtnisbildung. Interessanterweise deuten mehrere kürzlich veröffentlichte Publikationen darauf hin, dass miRNAs (und/oder siRNAs) bei der Regulation epigenetischer Modifikationen und alternativen Spleißens im Zellkern nicht-neuronaler Zellen eine Rolle spielen. Es war jedoch bislang unklar, ob miRNAs auch in neuronalen Zellkernen die Genexpression durch diesen Mechanismus regulieren können. Voraussetzung für die Analyse der miRNA Funktion im Zellkern von post-mitotischen Neuronen ist die Kenntnis des gesamten im Zellkern vorliegenden miRNA Repertoires. Mittels Microarray und Deep Sequencing Technologien habe ich deshalb zunächst jene miRNAs identifiziert, die im Zellkern von kortikalen Primärneuronen aus der Ratte angereichert sind (Khudayberdiev et al., 2013; Frontiers in Mol. Neurosci, zur Veröffentliching angenommen). Danach habe ich die unterschiedliche Expression spezifischer im Zellkern angereicherter miRNAs mittels Northern blot, quantitativer real-time PCR und fluoreszenter in situ Hybridisierung validiert. Durch Quervergleich mit publizierten Daten konnte ich herausfinden, dass die Anreicherung von miRNAs im Zellkern möglicherweise mit ihrer Herunterregulation während der in vitro Entwicklung kortikaler Neuronen einhergeht. Des Weiteren konnte ich eine Überrepräsentation von Guanin am 3’ Ende von im Zellkern angereicherten miRNA Isoformen (isomiRs) nachweisen, die auf einen Neuronen-spezifischen Mechanismus der nukleären miRNA Lokalisierung hindeutet. Insgesamt stellen diese Resultate einen Ausgangspunkt für künftige Studien dar, die sich der Funktion spezifischer miRNAs im Zellkern und den detaillierten Mechanismen der subzellulären Lokalisierung von miRNAs in Neuronen widmen. Zusammenfassend zeigen die in meiner kumulativen Dissertation beschriebenen Arbeiten, dass die aktivitätsabhängige Regulation spezifischer miRNAs in verschiedenen subzellulären neuronalen Kompartimenten (Dendriten, Zellkern, Zellkörper) eine wichtige Rolle für die neuronale Morphogenese (Entwicklung von Dendriten und dendritischen Dornfortsätzen) und Plastizität spielt.