Molecular biological and biochemical investigations on the biosynthetic enzymes of prenylated indole alkaloids from fungi

Prenylated indole alkaloids are widely distributed in plants, fungi and bacteria, especially in the family of Clavicipitaceae and Trichocomaceae of Ascomycota, and commonly exhibit interesting biological and pharmaceutical activities. In the biosynthetic pathway of prenylated indole alkaloids, preny...

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Main Author: Yu, Xia
Contributors: Li, Shu-Ming (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2013
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Table of Contents: Prenylierte Indolalkaloide sind ubiquitär in Pflanzen, Bakterien und Pilzen verbreitet, vor allem in den Familien Clavicipitaceae und Trichocomaceae der Ascomyceten. Gemeinsam weisen sie interessante biologische und pharmazeutische Aktivitäten auf. Bei der Biosynthese von Indolalkaloiden ist die Prenylierung durch Prenyltransferasen maßgeblich für die hohe Strukturvielfalt dieser Substanzen in der Natur verantwortlich. Biochemische Untersuchungen zu Indolprenyltransferasen können helfen, die Entstehung von prenylierten Indolalkaloiden in der Natur zu verstehen. Außerdem können Indolderivate und anderen Substanzen durch Prenyltransferasen modifiziert werden. Drei Indolprenyltransferasen der Dimethylallyltryptophan Synthase (DMATS) Superfamilie wurden biochemisch identifiziert und in vitro charakterisiert, diese beinhalteten CdpC3PT aus Neosartorya fischeri (N. fischeri), BrePT aus Aspergillus versicolor (A. versicolor) und 5-DMATS aus Aspergillus clavatus (A. clavatus). Die verantwortlichen Gene cdpC3PT und brePT wurden jeweils in einen Expressionsvektor kloniert und heterolog in Escherichia coli (E. coli) exprimiert. Diese Arbeiten wurden von Dr. Wen-Bing Yin, Suqin Yin und Qing Wang durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde herausgefunden, dass CdpC3PT die Entstehung von C3-prenylierten Produkten mit einem charakteristischen 6/5/5/6-tetrazyklischen Ringsystem aus tryptophan-haltigen zyklischen Dipeptiden in einem Reaktionsschritt katalysiert. Das NotF-Homolog BrePT zeigte eine sehr viel höhere Flexibilität gegenüber seinen aromatischen Substraten im Vergleich zu NotF. Dabei konnte eine hohe Regiospezifität einer reversen Prenylierung an Position C-2 des Indolrings nachgewiesen werden. Bei der Charakterisierung von 5-DMATS wurde die Klonierung von Yan Liu durchgeführt. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit erfolgte meinerseits die Aufklärung der Genfunktion durch heterologe Expression in E. coli und die anschließende Strukturaufklärung der Enzymprodukte mit Hilfe von Massenspektrometrie (MS) und Kernresonanzspektroskopie (NMR). 5-DMATS katalysiert eine regiospezifische Prenylierung von Indolderivaten an Position C-5. Aufgrund der enormen Bedeutung der Prenylierung an der Strukturvielfalt und damit der biologischen Aktivität, wurden CdpC3PT, BrePT, 5-DMATS und andere bekannte Prenyltransferasen der DMATS-Superfamile zur chemoenzymatischen Synthese von prenylierten Substanzen verwendet. Durch Einsatz von AnaPT, CdpC3PT und CdpNPT, konnten jeweils acht und sechs Stereoisomere von cis-konfigurierten prenylierten Pyrroloindolin-Diketopiperazinen von cyclo-Trp-Ala und cyclo-Trp-Pro Isomeren produziert werden. Die Stereospezifität von AnaPT und CdpC3PT hängt dabei hauptsächlich von der Konfiguration der Tryptophaneinheit in cyclo-Trp-Ala und cyclo-Trp-Pro Isomeren ab. Im Vergleich dazu, zeigte CdpNPT eine geringere Stereoselektivität, aber eine höhere Umsetzungsrate gegenüber den getesteten Substraten. Weiterführend wurden 5-DMATS und FgaPT2 für die chemoenzymatische Synthese von prenylierten Indolcarbazolen eingesetzt. Die Rekonstruktion der Enzymaktivität von 5-DMATS und FgaPT2 in vitro zeigte, dass sie in der Lage sind, die regiospezifische Prenylierung von Indolcarbazolen an der para-Position des N-Atoms zu katalysieren. Dies ist der erste Bericht über derartige prenylierte Indolcarbazole. Desweiteren konnte auch die Akzeptanz einiger Hydroxynaphthalene und Flavonoide durch Indolprenyltransferasen der DMATS Superfamilie nachgewiesen werden, wobei diese eigentlich Substrate der Enzyme der CloQ/NphB-Gruppe, oder der UbiA-Superfamilie darstellen. Neun prenylierte Flavonoide und zwanzig prenylierte Hydroxynaphthalene wurden isoliert und deren Strukturen anschließend durch MS- und NMR-Analysen aufgeklärt. Dabei konnte festgestellt werden, dass für ein akzeptiertes Hydroxynaphthalen, unterschiedliche Enzyme das gleiche prenylierte Hauptprodukt produzieren, natürlich mit einer regulären C-Prenylierung an para- oder ortho-Position zu einer Hydroxygruppe. Bei Flavonoiden, welche von 7-DMATS akzeptiert wurden, war Position C-6 zwischen zwei Hydroxygruppen die bevorzugte Prenylierungsstelle. Die erhaltenen Michaelis-Menten Konstanten (KM) und die Wechselzahlen (kcat) einiger Prenyltransferasen für ausgewählte Hydroxynaphthalene waren vergleichbar mit denen von Indolderivaten. Ergänzend zu Prenyltransferasen wurden noch weitere Gene aus einem putativen Biosynthesecluster für ein prenyliertes Indolalkaloid, das Hexadehydroastechrom (HAS) untersucht. Ein putatives O-Methyltransferasegen hasC und ein putatives Cytochrome P450-Gen hasH, welche in dessen Biosynthese in Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) involviert sind. Sie wurden jeweils in die Expressionsvektoren pQE60 und pESC-URA kloniert. Das lösliche His6-HasC wurde erfolgreich in E.coli SG13009 überexprimiert und über Ni-NTA aufgereinigt. Konstrukte für die Co-Expression mit dem Reduktasegen NFIA_083630 aus N. fischeri in pESC-URA und für die Expression als His6-getaggtes Protein in pESC-URA wurden auch für das putative Cytochrome P450-Gen hasH angefertigt.