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Eine neue Facette im zellulären Anpassungsprozess von Bacillus subtilis an hohe Salinitäten : Die Analyse des osmotisch induzierten yqiHIK Operons
In seinem natürlichen Lebensraum ist der Mikroorganismus Bacillus subtilis zahlreichen Stressfaktoren ausgesetzt. Durch komplexe Regulations- sowie Differenzierungsprozesse (Biofilm-Formation, Sporulation) besitzt dieses Bakterium die Fähigkeit, sich an diverse Stresssituationen anzupassen. Die Verf...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2012
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | In seinem natürlichen Lebensraum ist der Mikroorganismus Bacillus subtilis zahlreichen Stressfaktoren ausgesetzt. Durch komplexe Regulations- sowie Differenzierungsprozesse (Biofilm-Formation, Sporulation) besitzt dieses Bakterium die Fähigkeit, sich an diverse Stresssituationen anzupassen. Die Verfügbarkeit von Wasser ist ein Beispiel für einen solchen Stressfaktor. Als eine zentrale Anpassungsstrategie an hyperosmotische Kulturbedingungen, konnte in B. subtilis die Akkumulation von kompatiblen Soluten durch Synthese und Aufnahme identifiziert werden. In Transkriptom-Analysen hyperosmotisch gestresster B. subtilis Kulturen wurden jedoch zahlreiche Gene identifiziert, die unter Hochsalz Bedingungen eine Induktion in der Genexpression zeigten.
Interessanterweise kristallisierte sich bei der Analyse dieser Transkriptom-Daten eine Gruppe von Genen heraus, denen eine Beteiligung am Zellwandmetabolismus zugesprochen werden konnte. Beispiele dafür sind die Gene yqiH sowie yqiI. Das Gen yqiH kodiert vermutlich für ein Lipoprotein, wohingegen das Protein YqiI Sequenzähnlichkeiten zu der Enzymklasse der N-Acetylmuramyl-L-Alanin Amidasen aufweist. Diese Enzyme gehören zu der Gruppe der Zellwandhydrolasen (Autolysine), die in wichtige zelluläre Prozesse involviert sind. Mit Hilfe der Zymographie konnte im Verlauf dieser Arbeit die hydrolytische Fähigkeit für das Protein YqiI in vitro bestätigt werden.
Außerdem wurde gezeigt, dass die Kultivierung von B. subtilis unter hyperosmotischen Bedingungen zu einer drastischen Veränderung in der Zellmorphologie führte, die ausschließlich während der Anpassungsphase auftrat. Die Ergebnisse der Transkriptom-Analysen und auch die Beobachtung der morphologischen Veränderungen führten zu der Hypothese, dass die Restrukturierung der Zellhülle eine neue Facette in der Adaptation von B. subtilis an hochsaline Bedingungen darstellen könnte. Um eine mögliche Beteiligung der Proteine YqiH sowie YqiI zu untersuchen wurden, diese im Rahmen der vorliegenden Arbeit einer biochemischen, physiologischen sowie regulatorischen Charakterisierung unterzogen.
Durch eine RT-PCR-basierende Methode konnte eine Co-Transkription der yqiHI Gene mit einem weiteren Gen yqiK erstmals gezeigt werden. Die Charakterisierung einer yqiHIK Deletionsmutante zeigte unter normalen physiologischen sowie hyperosmotischen Bedingungen eine Wachstums-verzögerung im Vergleich zum Wildtyp, was alleinig auf das Fehlen der Amidase YqiI zurückgeführt werden konnte. Darüber hinaus konnte ausgeschlossen werden, dass die YqiHIK Proteine wesentlich an der Restrukturierung der Zellwand beteiligt sind. Durch Reportergenstudien wurde die osmotische Induktion des yqiHIK Operons näher analysiert. Dabei zeigte sich, dass eine Expression des yqiHIK Genclusters nur bei sehr hohen NaCl-Konzentrationen erfolgte (> 0,7 M NaCl). Die Expression wird dabei über einen SigA-Promotor vermittelt, der mit Hilfe einer Primer-Extension-Analyse identifiziert werden konnte und ferner einer detaillierten Mutagenese-Studie unterzogen wurde. Verkürzungen in der yqiHIK Promotorregion führten zu der Identifikation einer AT-reichen Region, die kritisch für die Induktion des Operons unter hohen osmotischen Bedingungen war. Diese AT-reiche Region wurde als mögliche Binderegion für den Regulator DegU aus B. subtilis wiedererkannt. Die Beteiligung des Zwei-Komponenten-Systems DegS/DegU an der Induktion der Expression des yqiHIK Operons unter salinen Bedingungen, stellte dabei ein zentrales Ergebnis dieser Arbeit dar, wobei somit erstmalig ein Hinweis darauf gegeben wurde, wie die Zelle in der Lage ist, hohe NaCl-Konzentrationen wahrzunehmen und darauf zu reagieren.
Neben der Induktion des yqiHIK Operons unter hyperosmotischen Bedingungen wurden im Verlauf dieser Dissertation noch zwei weitere regulatorische Besonderheiten dieses Genclusters aufgedeckt. Zum einen konnte gezeigt werden, dass eine Induktion der Expression des yqiHIK Operons direkt nach Initiation der Sporulation erfolgte. Dabei wurde eine Beteiligung des SinR Regulators nachgewiesen, welcher auch die Expression dieses Operons unter normalen Wachstumsbedingungen verhindert. Darüber hinaus konnte eine Erhöhung der Transkription des yqiHIK Genclusters in der sogenannten „Todeszone“ beobachtet werden. Für beide dieser regulatorischen Aspekte wurde eine Beteiligung des zuvor identifizierten SigA-Promotors ausgeschlossen.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden somit drei physiologische Prozesse aufgedeckt, an denen die Genprodukte des yqiHIK Operons beteiligt zu sein scheinen, wobei die Transkription des yqiHIK Genclusters über mindestens zwei unterschiedliche Promotoren erfolgt. Zusätzlich wurden zwei Transkriptionsfaktoren identifiziert, die die Expression des yqiHIK Operons kontrollieren. Die Regulation des yqiHIK Operons ist ein gutes Beispiel dafür, wie facettenreich Bakterien ihre Umwelt wahrnehmen und genetisch darauf reagieren können. |
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| DOI: | 10.17192/z2013.0249 |