Investigations into the mechanism of the coenzyme B12 dependent reaction catalyzed by glutamate mutase from Clostridium cochlearium

Aims of this study were the search for inhibitors of the coenzyme B12-dependent glutamate mutase and for insight into the first step of its catalytic mechanism, the homolytic cleavage of the cobalt-carbon bond. Glutamate mutase is composed of two separately isolated protein components S and E2, whic...

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Main Author: Lyatuu, Fredrick Edwin
Contributors: Buckel, W. (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2012
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Ziele dieser Untersuchungen waren zum einen die Suche nach neuen Inhibitoren der Coenzym-B12 abhängigen Glutamat-Mutase und zum anderen der Mechanismus des ersten Schritts der Katalyse, die Homolyse der Kobalt-Kohlenstoff-Bindung. Das Enzym Glutamat-Mutase aus dem Glutamat-fermentierenden Clostridium cochlearium ist aus zwei getrennt isolierbaren Untereinheiten, S und E2 aufgebaut, die in sich in Gegenwart Coenzym-B12 zu dem enzymatisch aktiven Holoenzym E2S2-B12 vereinigen, das die reversible Isomerisierung von (S)-Glutamat zu (2S,3S)-3-Methylaspartat katalysiert. Diese Reaktion wurde mit der Deaminierung von Methylasparat zu dem bei 240 nm absorbierenden Mesaconat gekoppelt, um einen UV-spektrophotometrischen Test für die Glutamat-Mutase zu erhalten. Als potentielle Inhibitoren wurden Verbindungen ausgewählt, die sp2-Zentren und strukturelle Ähnlichkeiten zu den im Mechanismus postulierten Radikalen aufwiesen. Als Analoga zum 4-Glutamylreadikal wurden (E)- und (Z)-Glutaconat verwandt, während als Analoga zum 3-Methylenaspartat-Radikal Itaconat, Buta-1,3-dien-2,3-dicarboxylat, Mesaconat, Fumarat und Maleat eingesetzt wurden. Da alle diese ungesättigten Dicarbonsäuren das Hilfsenzym Methylaspartase inhibierten, wurde Glutamat-Mutase mit je einem der potentiellen Inaktivatoren inkubiert und nach Abtrennung der niedermolekularen Verbindungen mittels Gelfiltration, die Restaktivität bestimmt. Dabei zeigte sich, dass unerwarteter Weise nur Mesaconat, Fumarat und Maleat das Enzym inaktivierten. Um zu prüfen, ob die anderen Verbindungen das Enzym reversibel inhibierten, wurde ein neuer Test mit (2S,3S)-3-Methylaspartat, Pyruvat und NAD+ als Substrate ausgearbeitet. Mit Hilfe der Enzyme Glutamat-Pyruvat-Aminotransferase und (R)-2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase konnte die Bildung von Glutamat bei 340 nm gemessen werden. Dabei zeigte es sich, dass 2.5 mM Itaconat oder 8 mM (E)-Glutaconat die Glutamat-Mutase in Gegenwart von 200 mM (2S,3S)-3-Methylaspartat zu 50% inhibierten. Zur Überprüfung der Zuverlässigkeit des neuen Tests wurden die kinetischen Konstanten für (2S,3S)-3-Methylaspartat bestimmt: Km= 7 ± 0.07 mM, kcat= 0.54 ± 0.6 s-1and kcatKm-1= 77 s-1M-1. Daraus berechnet sich mit den bekannten Konstanten für Glutamat und der Briggs-Haldane Gleichung die Gleichgewichtskonstante Keq = [Glutamat] × [Methylaspartat]-1 = 16, die mit dem Literaturwert von 12 gut übereinstimmt. ... Das mutL Gen von Clostridium tetanomorphum liegt zwischen den strukturellen Genen der Glutamat-Mutase, mutE and mutS. Wir spekulieren, dass MutL als ATP-abhängiges Chaperon Co(II)alamin aus inaktiven Glutamat-Mutase-Komplexen entfernt. Die dabei freigesetzten Komponenten MutE und MutS vereinigen sich mit Coenzym B12 wieder zum aktiven Enzym. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde mutL in pASG-IBA3 und pASG-IBA5 Expressionsvektoren über den pre-entry vector IBA-20 kloniert. Die Expression in E. coli Rossetta führte zu guten Ausbeuten.