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Die Funktion der Coiled-Coil-Domäne im Nukleoprotein des Ebolavirus
Das Ebolavirus (EBOV) bildet mit dem Marburgvirus die Familie der Filoviren, die aufgrund ihres einzelsträngigen, negativ orientierten RNA-Genoms der Ordnung der Mononegavirales zugeteilt werden. Filoviren verursachen beim Menschen und bei nicht-menschlichen Primaten ein schweres hämorrhagisches...
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| Main Author: | |
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2012
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Das Ebolavirus (EBOV) bildet mit dem Marburgvirus die Familie der Filoviren, die
aufgrund ihres einzelsträngigen, negativ orientierten RNA-Genoms der Ordnung der
Mononegavirales zugeteilt werden. Filoviren verursachen beim Menschen und bei
nicht-menschlichen Primaten ein schweres hämorrhagisches Fieber mit einer
Mortalitätsrate bis zu 90%. Deshalb und weil es bisher keine spezifische Therapie und
keine Impfung gibt, werden Filoviren als Pathogene der Sicherheitsstufe 4 eingestuft.
Der Nukleokapsidkomplex des EBOV besteht aus dem nicht-segmentierten RNAGenom
sowie dem Nukleokapsidprotein NP, der viralen Polymerase L, dem
Polymerase-Ko-Faktor VP35 sowie VP30 besteht.
Gegenstand dieser Arbeit ist eine Coiled-Coil-Domäne innerhalb des NP, deren
Einfluss auf verschiedene Funktionen des NP untersucht werden sollte. Hierfür wurde
die Rolle der Coiled-Coil bei der Interaktion mit VP30 und VP35 analysiert. NPMutanten,
die entweder keine Coiled-Coil-3D-Struktur oder gar keine Coiled-Coil mehr
aufwiesen, konnten hier zwar noch mit VP35, aber nicht mehr mit VP30 interagieren.
Die Gründe hierfür sind vermutlich, dass VP35 mehrere Bindungsstellen besitzt und
VP30 entweder im Bereich der Coiled-Coilbindet oder die durch die Coiled-Coil
vermittelte Konformation des NP benötigt.
Weiterhin befasst sich diese Arbeit mit der Rolle der Coiled-Coil-Domäne bei der NPNP-
Interaktion und dem self assembly. Immunfluoreszenzanalysen ergaben, dass die
Bildung von NP-Einschlusskörpern, so genannter inclusions, von der Coiled-Coil-
Domäne abhängt. Coiled-Coil-defiziente Mutanten können aber noch durch NPwt in
inclusions rekrutiert werden, die Fähigkeit zur Selbstinteraktion ist also nur
eingeschränkt. Mittels eines Complementation Assays konnte gezeigt werden, dass die
Coiled-Coil-Domäne allein ausreichend für eine NP-NP Bindung sein kann.
Immunelektronenmikroskopischen Analysen konnten zudem zeigen, dass die Bildung
von NP-Helices, welche das Gerüst der Nukleokapside darstellen, ebenfalls nur bei
intakter Coiled-Coil-Domäne oder in Gegenwart von NPwt möglich ist. Eine Rolle
könnte hierbei entweder eine durch die Coiled-Coil-Domäne vermittelte
Oligomerisierung des NP oder RNA-Interaktion spielen, welche zur Bildung von Helices
wichtig ist.
Im letzten Teil der Arbeit wurde der Einfluss Coiled-Coil-Domäne auf die virale
Transkription untersucht. Hierbei zeigte sich im iVLP-Assay, dass eine nicht intakte
Coiled-Coil einen dominant negativen Effekt auf die Transkription hat. Dies ist
vermutlich dadurch bedingt, dass ohne intakte Coiled-Coil keine NP-Helices gebildet
werden können und so auch keine regulären Nukleokapside, welche für die
Polymerase als Matrize zur Transkription und Replikation dienen. |
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| DOI: | 10.17192/z2012.1027 |