Flagellar motor tuning - The hybrid motor in Shewanella oneidensis MR-1

Bacteria are exposed to constantly changing environments. An efficient way to navigate towards favourable conditions is flagella-mediated motility. Flagellar rotation is achieved by the bacterial flagellar motor, composed of the rotor and stator complexes which surround the rotor in a ring-like stru...

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Main Author: Paulick, Anja
Contributors: Thormann, Kai M. (Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2012
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Table of Contents: Bakterien sind in ihren Lebensräumen ständig wechselnden Bedingungen ausgesetzt. Dies erfordert eine aktive und gerichtete Fortbewegung, um das Überleben und die Anpassungsfähigkeit zu sichern. Ein höchst effizienter Weg der Fortbewegung wird durch die Rotation von Flagellen vermittelt. Der Modellorganismus Shewanella oneidensis MR-1 stammt – im Gegensatz zu anderen Shewanellen – aus einem Süßwasserhabitat und besitzt eine polare Flagelle, die sowohl von einem natriumabhängigen PomAB- als auch von einem protonenabhängigen MotAB-Statorsystem getrieben werden kann. Zwar wird der Flagellenmotor in S. oneidensis in erster Linie von PomAB betrieben, jedoch sind beide Statorsysteme durchgehend präsent und werden für maximale Geschwindigkeit der Flagellenrotation unter natriumlimitierenden Bedingungen benötigt. Für die Erzeugung des Drehmoments, bzw. der Rotation der Flagelle ist der Flagellenmotor – bestehend aus einem rotierendem Element, dem Rotor, und mehreren statischen Elementen, den Statoren – von essentieller Wichtigkeit. Obwohl die Statoren – welche den Rotor als ringähnliche Struktur einfassen – zur Erzeugung des Drehmoments fest in der Zellwand verankert sind, werden dessen Elemente stetig ausgetauscht, was erstaunlicherweise auch während der Rotation des Motors funktioniert. Klar ist bislang nur, dass sowohl Natrium- als auch Protonenabhängige Statoren denselben Motor antreiben können, jedoch wurde noch nie ein Hybridmotor beschrieben für dessen volle Leistung zwei verschiedene, gleichzeitig arbeitende Statorsysteme unabdingbar sind. Das wirft die Frage auf, wie PomAB und MotAB von S. oneidensis in einem Flagellenmotorsystem arbeiten. Während meiner Arbeit konnte ich ein neuartiges Modell für den dynamischen Statoraustausch, als Anpassung an unterschiedliche Salzkonzentrationen, im Flagellenmotor von S. oneidensis entwerfen. Eine wichtige Voraussetzung für dieses Modell war eine synchrone und von der Salzkonzentration unabhängige Expression von pomAB und motAB, deren Nachweis über transkriptionelle Fusionen an lucB erbracht wurde. Mit Hilfe von Fluoreszensfusionen der B-Untereinheiten der Statoren an mCherry wurde deutlich, dass eine Fraktion von PomB – im Gegensatz zu MotB – unabhängig von der Natriumkonzentration polar lokalisiert. Bei hohem Salzgehalt wird PomB effizienter rekrutiert und erschwert somit vermutlich den Einbau von MotAB in den Statorring. Dagegen ließ das Lokalisationsmuster unter niedrigen Natriumkonzentrationen auf einen zeitgleichen Einbau von PomAB und MotAB in den Statorring schließen. Interessanterweise wird MotB in Abwesenheit von PomAB unter allen Natriumbedingungen zum flagellierten Pol rekrutiert. Wird jedoch PomAB wieder produziert, wird MotAB aus dem Statorring in die Membran verdrängt und von PomAB ersetzt. Über eine Quantifizierung von sfGfp-PomB Molekülen wurde deutlich, dass sich die Anzahl von mindestens neun in salzhaltiger auf fünf PomAB Komplexe in salzarmer Umgebung reduziert. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass die Inkorporation von PomAB dynamisch und in direkter Antwort auf die Natriumbedingung erfolgt, während die Rekrutierung von MotAB von der Anzahl an inkorporierten PomAB Statoren abhängig ist. Zwei weitere Proteine, MotX und MotY wurden im Laufe dieser Arbeit als essentiell für die Funktionalität, jedoch nicht für die Rekrutierung, von PomAB oder MotAB in den Flagellenmotor beschrieben. Zusammenfassend unterstützen diese Daten das Modell des dynamischen Statoraustausches zur Anpassung des Flagellenmotors an wechselnde Umweltbedingungen. Der zeitgleiche Einbau von PomAB und MotAB in einen funktionellen Statorring lässt auf die Existenz eines Hybridmotors in S. oneidensis schließen. Es bleibt zu zeigen, welche Rolle MotAB in diesem bislang einzigartigen Hybridmotor übernimmt. Daher sole sich nun der zweite Abschnitt meiner Arbeit mit der biophysikalischen Charakterisierung des Flagellenmotors auf Einzelzellebene und somit mit der Analyse der Beteiligung von MotAB und PomAB an der Flagellenrotation beschäftigen. Dafür wurden zwei Assays etabliert, zum einen der “bead assay” und zum anderen der “tethered cell assay”. Die Vorrausetzungen dafür waren, eine lateral lokalisierte Flagelle und ein Antikörper gegen natives Flagellin, um sowohl die Anheftung der “beads” an die Flagelle, als auch die Anheftung der Flagelle an eine Oberfläche zu gewährleisten. Während der “Bead Assay” auf Kurzzeitmessungen beschränkt war, konnte der “tethered cell assay” funktional etabliert werden. Letzterer erlaubt nun einen konstanten Pufferwechsel und eine Modulierung des Statorproteinlevels. Erste Ergebnisse zeigten, dass der Motor des Wildtyps bei geringen Natriumkonzentrationen signifikant schneller rotiert, als der rein natriumabhängige Motor. Desweiteren konnte über die kontrollierte Produktion von PomAB ein schrittweiser Anstieg der Rotationsgeschwindigkeit beobachtet werden. Die Produktion von MotAB hingegen senkte die Geschwindigkeit eines PomAB-getriebenen Motors schrittweise ab. In anderen Arbeiten konnte bereits zuvor gezeigt werden, dass MotAB-getriebene Motoren geringere Rotationsgeschwindigkeiten erreichen, als PomAB-getriebene. Diese Ergebnisse deuten auf einen Einbau von MotAB hin, was in der Folge zu einem Abbremsen des PomAB getriebenen Motors führt. Die alleinige Produktion von MotAB konnte die Rotation des Zellkörpers nicht wiederherstellen. Jedoch können Zellen, welche nur MotAB besitzen, schwimmen, was impliziert dass MotAB prinzipiell funktional ist. Statorhomolgievergleiche deuten darauf hin, dass MotAB erst vor kurzem – vermutlich über lateralen Gentransfer in Zusammenhang mit der Anpassung an niedrige Salzbedingungen im Oneida See – in S. oneidensis gelangte. Die Aufnahme eines protonenabhängigen Stators erleichtert eventuell die Rotation der Flagelle im natriumarmen Süßwasserhabitat. Eine bioinformatischen Analyse aller sequenzierten bakteriellen Genome zeigte, dass multiple Statorsets bei Organismen mit nur einem Flagellensystem häufiger vorkommen, als bisher angenommen. Der dynamische Statoraustausch, mit dem S. oneidensis vermutlich seinen Flagellenmotor adaptiert, könnte auch in anderen Organismen eine Strategie zur Anpassung an schnell wechselnde Umweltbedingungen darstellen. S. oneidensis besitzt einen Hybridmotor, der sich vermutlich noch immer in einem Prozess der Optimierung befindet. Die spezifische Charakterisierung von MotAB und dessen Beitrag zur Rotation in einem dual getriebenen Statorring ist notwendig, um die Existenz eines funktionalen Hybridmotors auf biophysikalischer Ebene zu beweisen.