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Charakterisierungsstudien der biologischen und neurotrophen Eigenschaften des cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF)
Neurotrophe Faktoren ermöglichen das Überleben von Neuronen auch unter pathologischen Stressbedingungen sowie eine erneute Proliferation neuronaler Zellstrukturen nach Beschädigung. Neurotrophe Faktoren sind definiert als sekretierte Proteine. Sie werden nach Strukturhomologien, Rezeptoren und Si...
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| Main Author: | |
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2011
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Neurotrophe Faktoren ermöglichen das Überleben von Neuronen auch unter pathologischen
Stressbedingungen sowie eine erneute Proliferation neuronaler Zellstrukturen nach Beschädigung.
Neurotrophe Faktoren sind definiert als sekretierte Proteine. Sie werden nach
Strukturhomologien, Rezeptoren und Signaltransduktionswegen in verschiedene Familien
unterteilt. Die Bezeichnung „neurotropher Faktor“ umfasst Proteine mit unterschiedlichsten
Funktionen. Die neurotrophen Eigenschaften von CDNF, das zur CDNF/MANF
Proteinfamilie gehört, wurden durch intrastriatale Injektion und darauf folgende Protektion
und Proliferation von Neuronen in einem in vivo Schädigungsmodell nachgewiesen. Diese
Proteinfamilie könnte somit einen neuen Ansatz zu einer Therapiemöglichkeit von
neurodegenerativen Krankheiten bieten. CDNF und MANF haben ein Molekulargewicht von
ungefähr 21 kDa. Der Aminoterminus enthält eine globuläre Saposin-ähnliche (saposin like
protein SAPLIP)-Domäne, und der Carboxyterminus ist verwandt mit der Sequenz von
scaffold attachment factors (SAFs) und enthält analog zu SAFs eine redoxaktive
Cysteinbrücke eingebettet in ein CXXC-Motiv. Die biologische Funktion, Rezeptoren und
Wirkmechanismus der Neuroprotektion der CDNF/MANF Proteinfamilie sind bisher
unbekannt. In dieser Arbeit wurden unterschiedliche Versuche zur Charakterisierung der
Eigenschaften von CDNF und dessen SAPLIP-Domäne unternommen. Für alle Versuche
waren umfangreiche biotechnologische Vorarbeiten notwendig, die in der Forschungsabteilung
von CSL Behring, Marburg vorgenommen wurden.
Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Überprüfung der These, dass CDNF, ausgehend
von seiner SAPLIP-Domäne, transduktorische Eigenschaften besitzen könnte: Makromoleküle
in Zellen zu schleusen, ist durch die selektiv durchlässige Zellmembran nur sehr
beschränkt möglich. Diese Restriktionen erlauben nur einem sehr kleinen Teil möglicher
therapeutischer Substanzen den Zugang ins Zellinnere. Die natürliche Struktur von
beispielsweise Proteinen verhindert das passive Eindringen dieser Stoffe in die Zelle. In den
1980er Jahren wurden jedoch Peptidsequenzen entdeckt, die als Molekültransporter
Makromoleküle in das Zellinnere schleusen können. Die N-terminalen Domäne von CDNF
besitzt nicht die klassische Struktur proteinogener Molekültransporter, sie ist jedoch verwandt
mit Saposinen. Saposine und Saposin-ähnliche Domänen weiterer Proteine können Lipide
binden oder Zellmembranen permeabilisieren. Diese Eigenschaften führten zu der These, dass
auch die SAPLIP-Domäne von CDNF potentielle transduktorische Funktionen ausüben
könnte. Zur Überprüfung der These wurden CDNF-Fusionsproteine biotechnologisch
produziert und auf ihre transduktorischen Eigenschaften untersucht. Es konnte aber keine
Transduktion von CDNF oder Assoziation mit der Zellmembran detektiert werden.
Der zweite Teil der Arbeit zeigt die zelluläre Lokalisation von nativem CDNF. CDNF wird
als sekretierter neurotropher Faktor beschrieben. Die C-terminale KTEL-Sequenz von CDNF
weist jedoch eine große Ähnlichkeit zum allgemeinen ER-Retentionssignal KDEL auf. Wir
zeigen in dieser Arbeit mit unterschiedlichen Methoden zum ersten Mal, dass CDNF
tatsächlich im ER retardiert wird. Es wurden weiterhin CDNF-Mutanten mit verändertem CTerminus
produziert. Die CDNF-Mutante mit C-terminaler KDEL-Sequenz und natives
CDNF konnten nicht im Überstand von transfizierten Säugetier-Zellkulturen detektiert
werden. Im Gegensatz zu CDNF-Mutanten mit deletiertem, maskiertem oder anderweitig
verändertem C-Terminus, die im Kulturüberstand nachweisbar waren. Dieser Vergleich mit
unterschiedlichen CDNF-Mutanten zeigt die wichtige Funktion einer freien C-terminalen
KTEL-Sequenz bei der zellulären Lokalisation von CDNF.
Der dritte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den neurotrophen Eigenschaften von CDNF in
vitro. Nach erfolgreicher Protektion sollte durch molekulare und biochemische Methoden der
unbekannte Mechanismus der neuroprotektiven Wirkung von CDNF näher untersucht
werden. Verschiedene neuronale Zellkulturen wurden dafür mit 6-Hydroxydopamin oder
Glutamat geschädigt. Rekombinant hergestelltes CDNF oder dessen SAPLIP-Domäne
wurden extern zugeführt und der Einfluss der zugesetzten Proteine analysiert. Im Gegensatz
zu den vorherigen Ergebnissen in vivo, konnte in keinem der verwendeten in vitro Systeme
eine signifikante Protektion oder Proliferation durch CDNF beobachtet werden. |
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| DOI: | 10.17192/z2012.0792 |