Die Rolle der SPA Proteine auf den lichtregulierten Abbau von Arabidopsis thaliana Cryptochrom 2

Cryptochrome (CRY) sind UV-A/Blaulicht Photorezeptoren, die in allen Organismenreichen vorkommen und eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu DNA-Photolyasen haben. Sie tragen die gleichen Kofaktoren wie DNA-Photolyasen, zeigen aber mit Ausnahme der cryDASH-Familie keine DNA-Reparaturaktivität. Cryptoc...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Weidler, Guido
Beteiligte: Batschauer, Alfred (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2012
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Cryptochrome (CRY) sind UV-A/Blaulicht Photorezeptoren, die in allen Organismenreichen vorkommen und eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu DNA-Photolyasen haben. Sie tragen die gleichen Kofaktoren wie DNA-Photolyasen, zeigen aber mit Ausnahme der cryDASH-Familie keine DNA-Reparaturaktivität. Cryptochrome nutzen stattdessen das Lichtsignal, um um in Pflanzen deren Entwicklung zu steuern. Cryptochrom 1 (CRY1) und 2 (CRY2) aus Arabidopsis thaliana vermitteln nach Absorption des Lichtsignals über die in ihrer N-terminalen PHR (photolyase related) Domäne gebundenen Chromophore die Signalweiterleitung über ihre C-terminale Extension an downstream Interaktionspartner. Eine lichtabhängige Phosphorylierung sowie Dimerisierung scheint für beide Cryptochrome für die Signaltransduktion und ihre biologische Funktion essentiell zu sein. Während CRY1 lichtstabil ist, wird CRY2 nach Blaulichtbelichtung schnell abgebaut. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von Arabidopsis CRY2. Insbesondere die Prozesse der Dimerisierung, der Phosphorylierung und des lichtgesteuerten Abbaus wurden näher untersucht. Cryptochrom 2 interagiert über seinen C-Terminus (CCT2) mit der C-terminalen WD-40 Domäne von COP1, einer E3-Ligase, die als Repressor der Photomorphogense in Pflanzen fungiert. Des Weiteren haben unter anderem Untersuchungen in unserer Arbeitsgruppe gezeigt, dass nur die dimere Form von CCT2 biologisch aktiv ist. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, CCT2 als Fusion mit dem Rapalog-induzierbaren FKBP(v)-Protein, sowie COP1 als Volllängen- oder verkürztes Protein, welches nur aus der C-terminalen Domäne besteht, in E. coli löslich zu exprimieren und anschließend mittels Affinitätschromatographie aufzureinigen. Mit Hilfe dieser Proteine sollte geklärt werden, ob nur die dimere Form von CCT2 mit COP1 interagiert. Hierfür waren Co-Immunopräzipitationsanalysen (Co-IP) geplant. Weiterhin sollten die gereinigten Proteine für Kokristallisationsexperimente eingesetzt werden. Die Ausbeuten an löslichem COP1, bzw. verkürzter COP1 Proteine waren gering und Versuche der Optimierung der Expression gelangen nicht. Des Weiteren zeigte sich, dass das CCT2-Fusionsprotein nach Expression in E. coli und nachfolgender Aufreinigung und Ankonzentrierung Oligomere bereits ohne Zugabe des chemischen Inducer bildet. Dennoch wurden Co-IPs durchgeführt, die aber keine Aussage darüber ermöglichten, ob CCT2 als Dimer für die Interaktion mit COP1 vorliegen muss. Aufgrund der vorgenannten Probleme war eine Kokristallisation von CCT2 mit COP1 nicht möglich. Die blaulichtabhängige Phosphorylierung und der Abbau von CRY2 in vivo wurde durch immunologische Analysen untersucht. Inbesondere wurde hierbei der Frage nachgegangen, welchen Einfluss Mitglieder der SPA-Proteinfamilie auf die Phosphorylierung und den Abbau von CRY2 haben. Die vier in Arabidopsis vorhandenen SPA Proteine fungieren zusammen mit COP1 ebenfalls als Repressoren der Photomorphogenese. Zur Beantwortung der Frage, ob SPA-Proteine am Abbau von CRY2 beteiligt sind, wurden CRY2 Gehalte in zahlreichen spa Mutanten untersucht. Weiterhin wurde eine mögliche Interaktion von SPA Proteinen mit CRY2 in vitro überprüft. Es konnte hierbei ein Einfluss der SPA Proteine auf die Stabilität von CRY2 im Blaulicht gezeigt werden, inbesondere unter niedrigen Fluenzraten. In Co-IP Analysen wurde eine direkte Interaktion von CRY2 mit SPA1 und SPA4 gezeigt. Zusammengefasst zeigen die erzielten Ergebnisse, dass SPA-Proteine am Abbau von CRY2 beteiligt sind und hierfür vermutlich eine direkte Interaktion von CRY2 mit SPA1 und SPA4 erforderlich ist. Weitere Analysen von CRY2 Proteinleveln in phyA Mutanten zeigten einen bis dahin unbekannten Einfluss von Phytochrom A auf die Stabilität von CRY2. Konsistent mit der Rolle der SPA-Proteine im Signalweg von phyA wiesen die phyA-Mutanten im niedrigen Fluenzratenbereich höhrere CRY2-Level als der Wildtyp auf. Dieser phyA Effekt wurde nur im Blaulicht, nicht aber unter Rot- und Dunkelrotlicht beobachtet. Somit kann davon ausgegangen werden, dass für den Abbau von CRY2 dessen vorherige Aktivierung durch Blaulicht zwingend erforderlich ist. Die Analyse einer phyB-Mutante zeigte hingegen keinen Unterschied zum Wildtyp. D
DOI:10.17192/z2012.0491