Anaerober Toluol-Stoffwechsel in Thauera aromatica: Biochemische und spektroskopische Untersuchungen zur Reaktion der (R)-Benzylsuccinat Synthase
Der initiale Schritt des anaeroben Toluol-Abbaus in dem denitrifizierenden β-Proteobakterium Thauera aromatica wird durch eine stereospezifische Addition der Methylgruppe von Toluol an die Doppelbindung von Fumarat unter Bildung des Produkts (R)-Benzylsuccinat eingeleitet. Die Reaktion wird von der...
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Contributors: | |
Format: | Doctoral Thesis |
Language: | German |
Published: |
Philipps-Universität Marburg
2012
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Subjects: | |
Online Access: | PDF Full Text |
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Summary: | Der initiale Schritt des anaeroben Toluol-Abbaus in dem denitrifizierenden β-Proteobakterium Thauera aromatica wird durch eine stereospezifische Addition der Methylgruppe von Toluol an die Doppelbindung von Fumarat unter Bildung des Produkts (R)-Benzylsuccinat eingeleitet. Die Reaktion wird von der (R)-Benzylsuccinat Synthase (BSS) katalysiert, die ein Mitglied der Glycylradikal-Enzymfamilie ist, zu deren Vertretern auch die anaerobe Ribonukleotid Reduktase, die Pyruvat-Formiat-Lyase und die 4-Hydroxyphenylacetat Decarboxylase zählen. Im Gegensatz zu den meisten anderen Glycyradikalenzymen ist die BSS aus mehreren Untereinheiten aufgebaut
(α2β2γ2-Komposition) und besitzt zudem Eisen-Schwefel-Cluster als Kofaktoren mit bisher unbekannter Funktion. Alle Mitglieder der Glycylradikal-Enzymfamilie können eindeutig anhand ihrer Sequenzähnlichkeit und ihres charakteristischen Glycylradikalsignals in EPR-spektroskopischen Analysen identifiziert werden. Die katalytisch aktive Form aller Glycylradikal-Enzyme wird erst durch die posttranslationale Generierung des Glycylradikals mit Hilfe des jeweils spezifischen aktivierenden Enzyms erhalten. Das Gen für das aktivierende Enzym der (R)-Benzylsuccinat Synthase ist zusammen mit den Genen für die BSS-Untereinheiten in einem Operon kodiert (bss-Operon).
I
In der vorliegenden Arbeit wurden die Zusammensetzung und weitere Eigenschaften der FeS-Cluster in rekombinant produzierter BSS mit Hilfe von UV/Vis-, EPR- und Mössbauer-spektroskopischen Analysen untersucht. In rekombinanter, nicht-aktivierter BSS wurden mindestens zwei unterschiedliche Typen magnetisch gekoppelter [4Fe4S]-Cluster mit sehr niedrigen Redoxpotentialen (< -450 mV) nachgewiesen, die eine sehr geringe Distanz (< 10 Å) relativ zueinander aufweisen. Eine Lokalisation der Eisen-Schwefel-Cluster wird basierend auf einem Aminosäure-Sequenzalignment mit anderen Fumarat-addierenden Enzymen für die kleinen β- und γ- Untereinheiten vorhergesagt. Rekombinant produzierte BSS wurde außerdem für Röntgenstrukturanalysen verwendet. Die erhaltenen Kristalle streuten mit einer Auflösung von 4 Å, was zwar noch keine vollständige Strukturaufklärung zulässt, jedoch die Zusammensetzung der BSS-Untereinheiten in
α2β2γ2-Komposition mit Hilfe der „Cell-Content“-Analyse bestätigt.
II
Es wurden biochemische und spektroskopische Untersuchungen zum Reaktionsmechanismus der
(R)-Benzylsuccinat Synthase mit aktivierter BSS in T. aromatica Rohextrakt durchgeführt. Aufgrund der signifikanten Reduktion der Enzymaktivität mit [2H2]Toluol, wurde die Abstrahierung des Wasserstoffatoms von der Methylgruppe von Toluol als geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Enzymreaktion identifiziert. Weiterhin wurden Studien mit bereits bekannten und neuen Inhibitoren der (R)-Benzylsuccinat Synthase durchgeführt. Durch detaillierte inhibitionskinetische Studien mit Benzylalkohol und einer Mischung aus Benzylfumarat/Benzylmaleat wurden neue Erkenntnisse bezüglich des Reaktionsmechanismus der BSS gewonnen. Benzylalkhol wurde als gemischter Inhibititor und Benzylfumarat/Benzylmaleat als unkompetitiver identifiziert.
Für die weitere Aufklärung des Reaktionsmechanismus ist die Identifizierung stabiler radikalischer Intermediate sehr wertvoll. Durch EPR-spektroskopische Analysen mit T. aromatica Rohextrakt wurde im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal ein kohlenstoff-basiertes Radikalintermediat in einem Glycylradikalenzym nachgewiesen. Die Ergebnisse stützen signifikant den Reaktionsmechanismus der BSS und grundlegend den für alle Glycylradikalenzyme postulierten radikalischen Reaktionsmechanismus.
III
Die Produktion des aktivierenden Enzyms (BssD) der (R)-Benzylsuccinat Synthase wurde optimiert und das Enzym mittels Affinitätschromatographie unter strikt anaeroben Bedingungen gereinigt. Durch UV/Vis- und EPR-spektroskopischen Analysen wurden redoxaktive [4Fe4S]-Cluster identifiziert, entsprechend der Vorhersage des Aminosäure-Sequenzalignments. Basierend auf diesen Ergebnissen können in Zukunft weitere Studien zur Aktivierbarkeit der (R)-Benzylsuccinat Synthase durchgeführt werden. |
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DOI: | 10.17192/z2012.0485 |