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Strukturmodell des Terminationsmoduls der Surfactin Synthetase
Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) zeigen, trotz der hohen Anzahl ihrer Bausteine und der somit großen Vielfalt ihrer Produkte, eine konstante strukturelle Verwandtschaft. Die NRPS‐Systeme sind modular aufgebaut, wobei definierte Domänen die einzelnen Reaktionen katalysieren. Neben den kata...
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| Main Author: | |
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2012
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) zeigen, trotz der hohen Anzahl ihrer Bausteine und der somit
großen Vielfalt ihrer Produkte, eine konstante strukturelle Verwandtschaft. Die NRPS‐Systeme sind
modular aufgebaut, wobei definierte Domänen die einzelnen Reaktionen katalysieren. Neben den
katalytischen Domänen ist die Rolle des dynamischen Peptidyl‐Carrier‐Proteins (PCP) für das Verständnis
der NRPS‐Wirkungsweise entscheidend. Studien vergleichbarer Systeme zeigen, dass die das Carrier‐
Protein umgebenden Linkerregionen aus Prolin‐ und Alanin‐reichen Sequenzen bestehen, wodurch die
Bildung von Sekundärstrukturen erschwert und die Dynamik dieser Domänen unterstützt wird.
Erst die in dieser Arbeit durchgeführte Arretierung der dynamischen PCP‐Domäne durch rationale
Mutagenese ermöglichte die Beobachtung des Kristallwachstums und somit die erste Strukturaufklärung
eines vollständigen NRPS‐Moduls. Die Struktur des Terminationsmoduls der Surfactin Synhtetase (SrfACS1003A)
zeigt die Interaktion der dynamischen PCP‐Domäne mit der katalytischen Kondensationsdomäne
(C‐Domäne). Das SrfAC‐Strukturmodell beschreibt die erste Struktur einer DC L‐Domäne. Desweiteren
konnte die Bildung einer engen Interaktion zwischen der Kondensations‐ und den zwei Subdomänen der
Adenylierungsdomäne (Acore‐ und Asub‐Domäne), die als Workbench bezeichnet wird, festgestellt werden.
Dabei nimmt die Asub‐Domäne eine bisher nicht beobachtete Konformation ein. Die C‐ und Acore‐Domäne
repräsentieren 83% der Masse eines Elongationsmodules (C‐, A‐ und PCP‐Domäne), auf deren starrem
Gerüst die dynamische Asub‐ und PCP‐Domäne interagieren. Anschließende Untersuchungen mittels der
Kleinwinkel‐Streuung (SAXS) zeigten, dass diese enge Interaktion auch im solvatisierten Zustand bestehen
bleibt. Somit konnte die wichtige Rolle der Workbench, auch als Modell‐System für das generelle
Verständniss der NRPS‐Systeme, bestätigt werden.
Die Strukturaufklärung des vollständigen NRPS‐Moduls ermöglicht die eindeutige Definition der
flankierenden PCP‐Linkerbereiche. Ihre sequenzielle Analyse zeigt, dass diese Bereiche aus Prolin‐ und
Alanin‐reichen Sequenzen bestehen und somit nicht zur Bildung von Sekundärstrukturen neigen. Dagegen
teilt der α‐helikale Linkerbereich zwischen der C‐ und A‐Domäne nicht die Affinität zu Prolin‐ und Alaninreichen
Sequenzen und ist zur Bildung von Sekundärstrukturen fähig.
Zusätzlich konnte in dem SrfAC‐S1003A‐Strukturmodell die spezifische Interaktion zweier Synthetasen
über ein Helix‐Hand‐Motiv gezeigt werden. Dabei interagiert die C‐terminale α‐Helix (COM‐Helix) der
ersten Synthetase mit dem in die C‐Domäne integrierten Hand‐Motiv der nachfolgenden Synthetase.
Dadurch ist die spezifische Erkennung der Synthetasen untereinander gewährleistet, wodurch die
Synthesereihenfolge erhalten bleibt (assembly line).
Durch die Kombination mit der Bidomänen‐Struktur aus TycC konnte desweiteren ein multimodulares
NRPS‐Modell erstellt werden. Dieses Modell zeigt eine linksläufige Schraubachse, bei der jedes Modul
entlang der Assembly‐Line um 120° gedreht ist. Weitere Untersuchungen mittels CyoEM an trimodularen
NRPS‐Systemen sollen diese Modul‐Anordnung bestätigen. Neben der globalen Architektur der NRPS,
zeigt das Akzeptor‐Modell auch die ersten strukturell aufgeklärten Linkerbereiche einer swinging domain.
Die in dieser Arbeit erstmals aufgeklärte Struktur eines NRPS‐Moduls ermöglicht neue synthetische und
chemoenzymatische Ansätze für rationales Design und protein engineering an den nichtribosomalen
Peptidsynthetasen und so den Zugang zu neuen biologisch wirksamen Peptidverbindungen. |
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| DOI: | 10.17192/z2012.0475 |