Identification and functional characterisation of dL(3)mbt-containing complexes in Drosophila melanogaster

Das Drosophila Protein Lethal (3) malignant brain tumour (dL(3)mbt) war das Gründungsmitglied der Familie der MBT-Domänen Proteine. Die MBT-Domäne ist ein sogenannter “Chromatin-Leser“, ein Modul, das spezifisch an mono- und di-methylierte Lysine, die in Histon-Schwänzen lokalisiert sind, bindet. In vitro Studien legen nahe, dass diese Domänen Nukleosomen kompaktieren, um dichter gepacktes Chromatin zu erzeugen. Bedeutenderweise wurde im Vorfeld gezeigt, dass MBT-Domänen enthaltende Proteine entscheidende Funktionen in Entwicklungsprozessen, der Erhaltung von transkriptioneller Repression und Tumorsuppression übernehmen. Dementsprechend führt die Mutation des Gens, das für dL(3)mbt kodiert, zur Entwicklung eines malignen und invasiven Tumors im Larvengehirn des dritten Larvenstadiums. Daten sowohl aus Drosophila melanogaster als auch dem humanen System implizieren, dass MBT-Domänen Proteine im Allgemeinen Proteinkomplexen, die mehrere Unter-einheiten enthalten, angehören oder mit ihnen zusammenwirken. Daher war das Ziel dieser Arbeit neue Interaktionspartner und Proteinkomplexe von dL(3)mbt zu identifizieren. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass dL(3)mbt mit enzymatischer Histon-deacetylaseaktivität assoziiert. dRpd3 wurde als eine Histondeacetylase identifiziert, die spezifisch mit dL(3)mbt interagiert. Interessanterweise waren die drei MBT-Domänen ausreichend, um die Bindung mit dRpd3 zu vermitteln. Die Funktion dieses dL(3)mbt-dRpd3-Komplexes wurde in Zusammenhang gebracht mit der „Reifung“ von neu synthetisiertem Chromatin. Im zweiten Teil dieser Studie wurde der Proteinkomplex LINT, der aus dL(3)mbt, dem Korepressor dCoREST und einem neu identifizierten Protein namens dLint-1 besteht, mittels FLAG-Immunoaffinitäts-Aufreinigung und klassischer Chromatographie isoliert. Diese Faktoren interagieren stabil miteinander in Extrakten, die von Zelllinien, Embryonen und larvalen Gehirnen gewonnen wurden. Auf Polytän-Chromosomen kolokalisierten die beiden LINT-Untereinheiten dL(3)mbt und dLint-1 in hohem Umfang an vielen Bindungsstellen. Anschließende Microarray-Analyse führte zur Identifizierung Hunderter Gene, die von dL(3)mbt und dLint-1 koreguliert wurden. Innerhalb dieser Zielgene war eine Untergruppe von Keimbahn-spezifischen Genen, die stabil von allen drei LINT-Komponenten reprimiert wurden. Auffallend ist, dass es einen signifikanten Überlapp mit Genen gibt, die das Tumorwachstum in l(3)mbt mutanten Gehirnen fördern. Weiterhin, bestätigte diese Arbeit, dass der LINT-Komplex direkt an die Promotoren dieser Zielgene bindet, um die Transkription zu unterbinden. Die Untersuchung eines Reportergen-Systems machte deutlich, dass die Rekrutierung von dL(3)mbt und dLint-1 an den Promotor eines Luciferasegens ausreicht, um dessen Transkription zu reprimieren und dass die maximale Repression abhängig ist von der Anwesenheit aller LINT-Untereinheiten. The Hochregulierung von LINT-Zielgenen wurde von Veränderungen von Histon-modifikationen begleitet, nämlich dem Anstieg von aktiven und dem Verlust von repressiven Histonmodifikationen. Allerdings ist es, da der LINT-Komplex keine Histon-modifizierenden Enzyme enthält, wahrscheinlich, dass diese Veränderungen kotranskriptionell auftreten. Zusammengefasst, führen die Resultate dieser Arbeit zu einem Modell, in welchem der LINT-Komplex die Repression von Keimzell-spezifischen Zielgenen aufrechterhält, indem er den Zugriff von RNA Polymerase II und anderen aktivierenden Trans-kriptionsfaktoren auf ihre Promotoren behindert.