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Untersuchungen zum Einsatz nanopartikulärer Trägersysteme zur Transfektion von Immun- und Alveolarzellen mit therapeutischen DNAzymen
Asthma bronchiale gehört weltweit zu den häufigsten chronischen Lungenerkrankungen. Eine wichtige Rolle in der Pathogenese des allergischen Asthmas spielen T-Helferzellen (TH2) für deren Differenzierung und Aktivierung der Transkriptionsfaktor GATA-3 essentiell ist. Durch l...
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| Main Author: | |
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2012
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Asthma bronchiale gehört weltweit zu den häufigsten chronischen
Lungenerkrankungen. Eine wichtige Rolle in der Pathogenese des allergischen Asthmas
spielen T-Helferzellen (TH2) für deren Differenzierung und Aktivierung der
Transkriptionsfaktor GATA-3 essentiell ist. Durch lokale Applikation eines GATA-3
mRNA spaltenden DNAzyms - ein DNA-Oligonukleotid mit katalytischer Aktivität -
konnte im Tiermodell ein Asthma Phänotyp bereits erfolgreich therapiert werden. Die
Aufnahme der DNAzym-Moleküle in ihre Zielzellen ist jedoch auf Grund ihrer Ladung
und Größe herausfordernd, so dass in der vorliegenden Arbeit der Frage nachgegangen
wurde, ob natürliches Surfactant oder künstliche Vektoren die Aufnahme und somit die
Wirksamkeit von GATA-3 spezifischen DNAzymen verbessern können.
Zur Untersuchung in vitro setzten wir dafür ein fluoreszenzmarkiertes DNAzym ein,
dessen Aufnahme in verschiedene Zelllinien unter Einfluss von Surfactant sowie
Polyethylenimin (PEI) und Polyethylenimin-Polyethylenglycol (PEI-PEG) Polymeren
durchflusszytometrisch analysiert wurde. Zwei verschiedene Surfactant-Präparationen
(Alveofact®, Curosurf®) führten dabei in verschiedenen Versuchsaufbauten zu keiner
Veränderung der Aufnahme - unsere Ergebnisse liefern somit keinen Hinweis auf die in
der Literatur vertretene Hypothese, Surfactant verbessere die Aufnahme von DNA in
vitro. Die eingesetzten PEI und PEI-PEG Moleküle hingegen führten zu einer
effizienten Transfektion des DNAzyms. Alle PEI-PEG Polymere zeigten dabei eine
deutlich geringere Zytoxizität als unmodifiziertes PEI. Das PEI(25kDa)-g-PEG(5kDa)4
Molekül mit vier 5 kDa PEG-Seitenketten zeigte unter den untersuchten PEI-PEG
Molekülen die höchste Transfektionseffizienz, so dass dieses für einen initialen in vivo
Versuch ausgewählt wurde. In diesem Experiment wurde Mäusen mit einem
experimentell induzierten Asthma Phänotyp einmal täglich über vier Tage parallel zur
lokalen Allergenprovokation ein Komplex aus GATA-3 spezifischem DNAzym und
PEI-PEG Polymer intratrachael verabreicht. Dieses Protokoll führte jedoch zu einer
schweren, bei einigen Tieren sogar letalen Entzündung der Lunge. Der Effekt war dabei
abhängig von der Menge des verabreichten Polymers und am ausgeprägtesten in den
Tieren, die unkomplexiertes PEI-PEG ohne DNAzym erhielten.
Die von uns untersuchten DNAzym/PEI-PEG Komplexe erwiesen sich, ähnlich wie
bereits beschriebene siRNA/PEI-PEG Komplexe, als effektive Vektoren in vitro. Die beobachteten Nebenwirkungen in vivo deuten jedoch auf eine nicht unerhebliche
Toxizität dieser Komplexe hin. Da für den Einsatz in der chronischen Erkrankung
Asthma bronchiale von längeren Therapiezeiträumen auszugehen ist, sind dafür jedoch
besonders gut verträgliche therapeutische Systeme erforderlich. Daher muss die weitere
Entwicklung von Vektorsystemen für die lokale Applikation nukleinsäure-basierter
Therapeutika zum Ziel haben, die toxischen Eigenschaften dieser Komplexe bei
gleichen oder gar noch weiter verbesserten in vivo Transfektionseffizienzen signifikant
zu reduzieren. |
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| DOI: | 10.17192/z2012.0416 |