Untersuchung zur Etablierung einer Real-time-PCR zum schnellen Screening auf Clostridium difficile aus Patienten- und Umgebungsproben

Clostridium difficile ist der häufigste Erreger von Antibiotika-assoziierten Diarrhoen und hat in den letzten Jahren als nosokomialer Problemkeim stark an Bedeutung gewonnen. Das Bakterium ist grampositiv, stäbchenförmig, obligat anaerob und bildet Sporen aus. Bei einer Antibiotikatherapie wird d...

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Main Author: Albrecht, Ulla Maria
Contributors: Mutters, Reinier (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2011
Subjects:
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Description
Summary:Clostridium difficile ist der häufigste Erreger von Antibiotika-assoziierten Diarrhoen und hat in den letzten Jahren als nosokomialer Problemkeim stark an Bedeutung gewonnen. Das Bakterium ist grampositiv, stäbchenförmig, obligat anaerob und bildet Sporen aus. Bei einer Antibiotikatherapie wird die natürliche Darmflora gestört und Clostridium difficile kann sich leichter ansiedeln. Die Übertragung des Bakteriums erfolgt dabei in der Regel fäkal-oral über die Aufnahme von Sporen. Clostridium difficile kann drei bekannte Toxine ausbilden, Toxin A, Toxin B und das Binary-Toxin. Die Toxine verursachen schwere Diarrhoen bis hin zur pseudomembranösen Enterokolitis mit möglichem letalen Ausgang. Das Binary-Toxin wird nicht von allen pathogenen Stämmen gebildet, ist aber mit einer erhöhten Toxizität und Virulenz assoziiert. In den letzten Jahren sind weltweit gehäuft schwere Ausbrüche von Clostridium difficile assoziierten Diarrhoen dokumentiert worden, die mit dem neu aufgetretenen, Binary-Toxin bildenden Stamm Nap1/027 in Verbindung gebracht werden. Außerdem wurden vermehrt Clostridium difficile assoziierte Diarrhoen außerhalb von Kliniken in der Normalbevölkerung beschrieben. Da infizierte Patienten eine große Zahl von Sporen ausscheiden, die resistent gegen herkömmliche alkoholische Desinfektionsmittel sind, können sie in klinischen Einrichtungen lange überdauern und stellen eine gefährliche Infektionsquelle für andere Patienten und Mitarbeiter dar. Aus diesem Grund müssen strikte Hygieneregeln eingehalten werden, sobald ein Patient an Clostridium difficile assoziierter Diarrhoe erkrankt ist. Gleichzeitig kommt einer möglichst schnellen Diagnostik große Bedeutung zu damit zügig entsprechende Maßnahmen eingeleitet werden können. In dieser Arbeit wurde ein Real-time-PCR Assay zum Nachweis und zur Quantifizierung der 16S rRNA von Clostridium difficile weiteretabliert, wobei das Real-time-PCR Assay eine hohe Sensitivität und Spezifität erreichte. Mit Hilfe der Real-time-PCR wurde extrahierte DNA aus 242 Stuhlproben von zwei Patientengrupen des Klinikums Marburg untersucht. Die erste Patientengruppe umfasste Patienten deren Stuhlprobe zuvor im Toxinimmunoassay auf Toxin A und B von Clostridium difficile positiv getestet worden war. In der zweiten Patientengruppe waren Patienten eingeschlossen, die zwar an Diarrhoe erkrankt waren, deren Stuhlprobe aber im Toxinimmunoassay negativ getestet worden war. Es konnte gezeigt werden, dass das verwendete Real-time-PCR Assay eine schnelle, sensitive und spezifische Methode darstellt, um Clostridium difficile in extrahierter DNA aus Stuhlproben zu detektieren. Alle Stuhlproben wurden zur Kontrolle zusätzlich mit einer konventionellen PCR auf Toxin A, Toxin B und das Binary-Toxin untersucht. Bis auf wenige Ausnahmen bestätigte sich im Test auf Toxin A und B das Ergebnis des Toxinimmunoassays. Bei 10 Proben konnte zudem das Binarytoxin nachgewiesen werden, was dafür spricht, dass auch im Klinikum Marburg bereits neuere Stämme von Clostridium difficile Einzug gehalten haben. In verschiedenen Studien konnte belegt werden, dass die Umgebung von mit Clostridium difficile infizierten Patienten stark mit Sporen kontaminiert ist. Um besonders kontaminierte Bereiche aufzuzeigen und die Verbreitung der Sporen zu dokumentieren, wurde DNA aus 531 Abstrichen der Patientenumgebung extrahiert und mit dem weiteretablierten Real-time-PCR Assay untersucht. Dabei wurden Proben aus der Umgebung infizierter Patienten mit Proben der Umgebung nicht infizierter Patienten, die aber mit infizierten Patienten auf einer Station lagen und Proben von Stationen, auf denen seit 6 Monaten kein Fall von Clostridium difficile mehr aufgetreten war, verglichen. Es wurde deutlich, dass nicht nur die direkte Umgebung von mit Clostridium difficile infizierten Patienten stark kontaminiert ist, sondern auch der ganze Stationsbereich. Auch in den Abstrichproben der Stationen, auf denen seit 6 Monaten kein infizierter Patient mehr gelegen hatte, konnte Clostridium difficile nachgewiesen werden. In einer Korrelationsanalyse wurde zudem deutlich, dass vor allem die Hände des Personals eine Hauptinfektionsquelle darstellen. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die erforderlichen Hygienemaßnahmen auf den untersuchten Stationen gar nicht oder nur unzureichend eingehalten werden. Um zu vermeiden, dass sich Stämme wie der neu aufgetretene, hypervirulente Stamm Nap1/027 weiter ausbreiten, ist es daher nötig, dass sowohl den Patienten als auch dem Personal deutlich gemacht wird, dass strikt eingehaltene Hygienemaßnahmen die einzige effektive Möglichkeit darstellen weitere Infektionen zu verhindern. Aufgrund der Resistenz der Sporen gegen alkoholische Desinfektionsmittel kommt hier dem Händewaschen neben der normalen alkoholischen Desinfektion eine besondere Bedeutung zu
DOI:https://doi.org/10.17192/z2011.0569