Towards Improved Aldose Reductase Inhibitors - Structural and Thermodynamic Investigation of Mutant and Wild Type Aldose Reductase Inhibitor Complexes

Rational drug design for flexible proteins like human aldose reductase comprises special challenges to find novel lead compounds or to improve known inhibitors. In this thesis, diverse aspects of the complexity of such a task were investigated to find promising new lead scaffolds and enhance the aff...

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Main Author: Koch, Cornelia
Contributors: Klebe, Gerhard (Prof.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2011
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Online Access:PDF Full Text
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Table of Contents: Rationales Wirkstoffdesign für flexible Proteine wie die humane Aldosereduktase ist mit verschiedenen Herausforderungen verbunden. Um neue Leitstrukturen zu finden und die Affinität bekannter Inhibitoren zu verbessern wurden innerhalb dieser Arbeit verschiedene Methoden angewendet, und dabei die unterschiedlichen Aspekte und deren Komplexität beleuchtet. Innerhalb aufeinanderfolgender Designzyklen ist die Voraussage von Bindungsmodi eines Liganden in einer anpassungsfähigen Bindetasche ein sehr komplexes Problem. Ein Benzothiazepin, das in einem vorhergehenden virtuellen Screening gefunden worden war, wurde kinetisch und strukturell im Komplex mit Aldosereduktase charakterisiert. Der dabei beobachtete, unerwartete Bindungsmodus mit einem neuen, bisher unbekanntem Proteinkonformer stellte die Basis für einen weiteren Designzyklus dar. Um das Grundgerüst zu optimieren, wurden Substituenten eingeführt, die eine Subtasche des Proteins direkt adressieren und neben der Affinität auch die Selektivität des Liganden gegenüber einem nahe verwandten Protein erhöhen sollten. Proteinflexibilität ist eine verbreitete Eigenschaft in Proteinen verschiedenster Funktionalität. Von Aldosereduktase sind eine Reihe unterschiedlicher Konformere bekannt, die im Komplex mit verschiedenen Bindungspartnern eingenommen werden. In einem Teil der Arbeit wurde der Einfluss von Inhibitoren auf die Ausbildung der verschiedenen Bindetaschenkonformere anhand von Zopolrestat und IDD393 im Komplex mit einer Threonin-113-Mutante sowie einem Benzothiazepin-Inhibitor im Komplex mit der Wildtypvariante von Aldosereduktase untersucht. Obwohl die direkte Interaktion zwischen Zopolrestat und der mutierten Aminosäure den Bindungsmodus nicht verändert, bewirkt sie eine Verschiebung des Inhibitorgrundgerüstes. Dies beeinflusst die Wechselwirkung mit einem benachbarten, beweglichen Loop, wodurch dieser weniger fixiert ist und Unordnung erfährt. Im Komplex mit IDD393 konnten zwei abweichende Bindetaschenkonformationen gefunden werden. Diese führten zu unterschiedlichen Kristallformen und konnten direkt miteinander verglichen werden: Die Verbesserung computergestützter Methoden zur Affinitätsvorhersage aus Protein-Ligand-Komplexen verlangt nach einem detaillierten Wissen um die Natur molekularer Wechselwirkungen und biomolekularer Erkennungsprinzipien. Kapitel 4 beschäftigt sich mit der Bindung zweier chemisch sehr ähnlicher Aldosereduktaseinhibitoren. Hochaufgelöste Röntgenstrukturen (0,92 - 1,35A) und kalorimetrische Bindungsdaten dieser Inhibitoren im Komplex mit einer Serie von Bindetaschenmutanten der Aldosereduktase wurden analysiert. Ein entscheidendes Threonin, das vermutlich an einem kurzen Brom-Sauerstoff-Kontakt, einer sogenannten Halogenbindung, beteiligt ist, wurde durch die strukturell ähnlichen Aminosäuren Alanin, Cystein, Serin und Valin ausgetauscht. Während sich der Bindungsmodus, oberflächlich betrachtet, nicht verändert, sind kleinste, aber signifikante geometrische Anpassungen erkennbar, die das Resultat der räumlichen und elektrostatischen Veränderungen durch die Mutation sind. Dazu gehören die Aufweitung eines zentralen Bindungswinkels im Inhibitor sowie die Verschiebung des Inhibitorgerüstes durch den Verlust oder die verstärkte Halogenbindung. Bemerkenswert ist die Übertragung dieser kleinen geometrischen Änderungen in starke Änderungen der thermodynamischen Bindungsprofile. Obwohl die freie Bindungsenergie sich insgesamt um nur etwa 7 kJ/mol ändert, lassen sich deutlich stärkere Anpassungen in den enthalpischen und entropischen Bindungsbeiträgen erfassen. Eine ausgeprägte Enthalpie-Entropie-Kompensation wird deshalb vermutet. Diese Effekte lassen sich durch die strukturellen Änderungen erklären. Diese Erkenntnisse liefern Hinweise, wie Mutationen das Selektivitätsprofil von chemisch ähnlichen Liganden beeinflussen können. Hochaufgelöste strukturelle Daten von Protein-Inhibitor-Komplexen bilden die Basis für wissensbasiertes Wirkstoffdesign. Die Verwendung von Synchrotronstrahlung ermöglicht atomare Auflösungen solcher Komplexstrukturen, ist allerdings mit der Gefahr von Strahlungsschäden an Protein oder Inhibitor verbunden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Struktur eines bromsubstituierten Inhibitors im Komplex mit einer Aldosereduktase-Mutante mit atomarer Auflösung bestimmt. Obwohl eine moderate Strahlungsdosis während des Experiments vorlag und kein Einfluss auf Proteinreste zu erkennen war, wurde der Bromsubstituent selektiv abgespalten. Die kovalente Bindung zum Brom wurde zerstört, wobei das abgespaltene Atom wider Erwarten wahrscheinlich als Bromid einem zusätzlichen Elektronendichtepeak zugeordnet werden konnte: Das Bromid nimmt eine neue Position in der Nähe ein, die durch vielversprechende Interaktionen mit benachbarten Aminosäuren stabilisiert wird.