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Quantification of the in-vivo affinity of PI(4,5)P2 effectors and sensors with the phosphoinositide phosphatase Ci-VSP
Zusammenfassung Quantifizierung der in-vivo Affinität von PI(4,5)P2- Effektoren und Sensoren mit der Phosphoinositidphosphatase Ci-VSP Phosphoinositide (PI) sind Mitglieder einer Familie kleiner Membranphospholipide, die wichtige Aufgaben in vielen eukaryotischen Signaltransduktionswegen übern...
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| Main Author: | |
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | English |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2011
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Zusammenfassung
Quantifizierung der in-vivo Affinität von PI(4,5)P2-
Effektoren und Sensoren mit der
Phosphoinositidphosphatase Ci-VSP
Phosphoinositide (PI) sind Mitglieder einer Familie kleiner Membranphospholipide,
die wichtige Aufgaben in vielen eukaryotischen Signaltransduktionswegen
übernehmen. Das PI Phosphoinositid(4,5)biphosphat (PI(4,5)P2) z.B. ist vorwiegend
in Plasmamembranen lokalisiert und reguliert viele zelluläre Funktionen, wie z.B. die
Aktivierung von Proteinen (z.B. Ionenkanäle). In Anbetracht der Vielfalt zellulärer
PI(4,5)P2 abhängiger Funktionen ist es unklar, wie eine Spezifität dieser Signalwege
erzielt werden kann, so dass z.B. nur ein Teil potentieller Effektorproteine auf eine
gegebene PI(4,5)P2 Konzentrationsänderung antwortet. Ein wichtiger Faktor, der die
Spezifität der PI(4,5)P2-Signalwege in Bezug auf die verschiedenen Zielproteine
bestimmt, ist die PI(4,5)P2-Affinität dieser Effektoren. Um den Einfluss dynamischer
PI(4,5)P2 Konzentrationsänderungen auf Effektorproteine zu verstehen, ist es
notwendig die PI(4,5)P2-Affinitäten dieser Proteine zu kennen. Jedoch fehlte den
bisherigen Methoden das Potential, die PI(4,5)P2-Affinität der Effektoren (z.B.
Ionenkanälen) unter physiologischen Bedingungen, wie z.B. in der lebenden Zelle, zu
untersuchen. Deshalb müssen die PI(4,5)P2-Affinitäten vieler Proteine immer noch
bestimmt werden.
In dieser Studie wurde eine spannungsgesteuerte 5’ Phosphatase des Ascids
Ciona intestinalis (Ci-VSP) als neues Werkzeug verwendet um die PI(4,5)P2-
Affinitäten von Effektoren und Sensoren zu quantifizieren. Ionenkanäle stellen eine
Klasse physiologisch relevanter PI(4,5)P2-Effektoren mit verschiedenen PI(4,5)P2-
Affinitäten dar und ihre Regulation durch PIs war Gegenstand weitreichender
Untersuchungen. Die Aktivität von einwärts rektifizierenden Kalium-(Kir) Kanälen wird
z.B. durch die Bindung von PI(4,5)P2 reguliert. Deshalb wurden Kir-Kanäle als
Modellsystem verwendet um abzuschätzen, wie gut Ci-VSP geeignet ist, die
PI(4,5)P2-Affinität dieser Kanäle festzustellen. Kir-Ströme wurden während der Ci-
VSP-Aktivität mit Hilfe von Whole-cell Patch-Clamp an CHO-Zellen und mit Hilfe von
Zwei-Elektroden Voltage-Clamp an Xenopus laevis Oocyten abgeleitet. Die Kir-
Ströme nahmen bei Depolarisation aufgrund der Ci-VSP-vermittelten PI(4,5)P2-
iv
Depletion ab und nahmen bei Repolarisation aufgrund der endogenen PI(4,5)P2-
Resynthese wieder zu. Der Gleichgewichtszustand der Kanaldeaktivierung bei
gradueller Ci-VSP-Aktivierung diente dem Auslesen des Grades der PI(4,5)P2-
Affinität. Aufgrund ihrer verschiedenen Affinitäten musste die Ci-VSP unterschiedlich
stark aktiviert werden um die untersuchten Kir-Kanäle zu deaktivieren. In
Übereinstimmung mit früheren Studien wurde ermittelt, dass Kir2.1WT-Kanäle eine
hohe, Kir1.1WT-Kanäle eine mittlere und Kir3-Kanäle eine niedrige PI(4,5)P2-Affinität
haben. Ebenfalls wurde die reduzierte PI(4,5)P2-Affinität von Mutanten (z.B. R228Q
in Kir2.1), die zu schweren Erkrankungen wie das Anderson Syndrom führen können,
erfolgreich mit Hilfe der Ci-VSP detektiert. Genauso konnte erfolgreich die sich
ändernde PI(4,5)P2-Affinität von Kir3-Kanälen bei Modulation durch Gβγ
nachvollzogen werden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Verwendung der Ci-VSP,
verglichen mit früheren Methoden PI(4,5)P2-Level zu manipulieren und Protein-
PI(4,5)P2-Affinitäten zu quantifizieren, eine graduelle und reversible Titration des
endogenen PI(4,5)P2 in intakten Zellen erlaubt.
Die Reliabilität der Ci-VSP wurde bekräftigt durch den Vergleich der
erhaltenen Resultate mit einer unabhängigen Methode PI(4,5)P2 zu depletieren. Die
Depletion wurde durch eine chemisch gesteuerte Membranrekrutierung einer 5’
Phosphatase, der Inp54p, erzielt. Die Ströme aller untersuchten Kir-Kanäle nahmen
infolge der Inp54p-induzierten PI(4,5)P2-Depletion, ähnlich wie bei Ci-VSPAktivierung
beobachtet, ab.
Zuletzt wurde die Ci-VSP dazu verwendet die kontroversen PI(4,5)P2-
Affinitäten zweier PI(4,5)P2-Bindungsdomänen (PLCδ1-PH-Domäne und tubby-CT)
aufzulösen um ihre Tauglichkeit in Bezug auf die Visualisierung von PI(4,5)P2-
Dynamiken in künftigen Studien abzuschätzen. Der dynamische Bereich des tubby-
CT-Sensors stimmte mit dem physiologischen PI(4,5)P2-Konzentrationsbereich
überein, welcher durch die Aktivität von KCNQ2-Kanälen in simultanen Messungen
mit Patch-Clamp angezeigt wurde.
Zusammengefasst zeigen die Resultate, dass Ci-VSP als neues Werkzeug
geeignet ist zuverlässig PI(4,5)P2-Level in lebenden Zellen reversibel und graduell zu
manipulieren. Ci-VSP erlaubt die quantitative Ermittlung von PI(4,5)P2-Sensitivitäten
zellulärer Effektoren und genetisch kodierter fluoreszierender Sensoren von
PI(4,5)P2-Signalwegen. |
|---|---|
| DOI: | 10.17192/z2011.0371 |