Structural and functional studies of mucin-interacting adhesion domains from Candida glabrata and Helicobacter pylori

Epitheladhäsine von C. glabrata Die Epitheladhäsine (Epa) sind zentrale Proteine in der Kolonisierung, Pathogenese und Virulenz von C. glabrata. Diese Adhäsine haben einen ähnlichen modularen Aufbau wie S. cerevisiae Flokuline, mit einer N-terminalen adhäsiven A-Domäne, einer halsartigen B-Domäne und einer C-terminalen C-Domäne, die als Verankerung an der Zellwand dient. Flokulin-artige Adhäsine können in vielen Fällen eine Calcium-bindende PA14 Domäne innerhalb der A-Domäne beinhalten. Diese Proteinen wurden als C-Typ Lektine eingestuft, da die PA14 Domäne für eine Calcium abhängige Glycan-Bindung verantwortlich ist[1]. In der folgenden Arbeit war es möglich, die Kristallstrukturen von Epa1A und drei Varianten mit Auflösungen von 1,4 bis 2,0 Å zu lösen. Die Varianten sollten die Spezifitäten der Epa2-, Epa3- und Epa6- adhäsiven A-Domänen emulieren. Diese Erkenntnisse erlaubten eine detaillierte Beschreibung der Bindungstasche von Epa1A und die Mechanismen, durch die die Spezifität in der Epa A- Domäne bestimmt werden. Besonders überraschend war die Tatsache, dass, obwohl die Proteine in Gegenwart von Laktose kristallisiert wurden, die Co-Kristalle keine Laktose zeigten. Stattdessen konnte nur ein Galaktoseβ1-3glukose Disaccharid in die Elektronendichte modelliert werden. Dieses Disaccharid findet sich für gewöhnlich auf Zelloberflächen und in Milchderivaten[2], aus denen die verwendete Laktose stammte. Die funktionelle Charakterisierung von Epa1A , Epa1→2A, Epa1→3A und Epa1→6A verlief über semiquantitative, Hochurchsatz Analysen in Zusammenarbeit mit dem Consortium for Functional Glycomics (CFG). Mit Fluoroforen markierte Proteine wurden mit Glykan Arrays in Kontakt gesetzt. Die Ergebnisse zeigten eine deutliche Präferenz im Falle von Epa1A für Oligosaccharide mit einer terminalen Galaktoseβ1-3 Verknüpfung. Für die anderen Proteinen konnte gezeigt werden, dass die Spezifität in unterschiedlichen Massen verringert war. Das Epa1→6A Bindungsprofil konnte mit der von Zupancic et. al. 2008 publizierten Daten für Epa6A verglichen werden und zeigte große Ähnlichkeit. Epa1→2A und 3A waren deutlich weniger aktiv, zeigten aber eine Präferenz für sulfatierte Glykane sowie für terminale Galaktosen. Quantitative Fluoreszenztitrationen ergaben ungefähr zwanzigfach höhere Affinitäten für das T-Antigen als für die aus Milch gewonnene Laktose, wodurch die Präferenz für β1-3 über β1-4 Verbindungen weiter bestätigt werden konnte. 1.4 Adhäsine von Helicobacter pylori Die Adhäsine von H. pylori zeigten sich als kritisch bei der Kolonisierung und Immunerkennung des Bakteriums während des Eindringens in den Magen und der Entstehung und Entwicklung der Krankheit[3]. BabA und SabA sind zwei besonders wichtige Adhäsine, da ersteres bei einer frühen Kolonisierung als Primäradhäsin wirkt, während SabA stark an entzündetes Gewebe bindet[4]. Es handelt sich bei beiden um Autotransporter, die mit einer C-terminalen, membrangebundenen Translokationseinheit und einer N-terminalen, adhäsiven transportierte Domäne versetzt sind. Reine, lösliche transportierte Domänen von BabA und SabA wurden in großen Mengen in Escherichia coli rekombinant überproduziert. BabA konnte, wie die Epa Proteine, mit Hilfe von Glykan Arrays funktionell charakterisiert werden. BabA-Aktivität erwies sich als stark pH-abhängig, da sich bei pH 5.8 eine etwa hundertfach stärkere Bindung als bei pH 2.5 zeigte. Dieses Verhalten konnte durch Circular-Dichroismus Spektroskopie und chromatographische Analyse weiter untersucht werden. Es zeigte sich, dass BabA bei pH 2.5 sich in eine relaxierten, molten-globule ähnlichen Konformation befand, die leicht aggregierte. Bei pH 5.8 andererseits befand sich das Protein in einer viel kompakteren, klarer definierten Konformation mit einer starken Tendenz zur Präzipitat-Entstehung. Es konnten schon mehrere H. pylori Virulenzfaktoren gefunden werden, deren Aktivität pH abhängig ist, aber bis jetzt gab es noch keine biochemischen Daten, die pH abhängige Konformationsänderungen bei ihren Adhäsinen belegten.