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Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Komponenten der eukaryotischen Eisen-Schwefel-Cluster-Biogenese-Maschinerie
Eisen-Schwefel-Cluster (Fe/S-Cluster) sind essentielle und vielseitige Kofaktoren zahlreicher Proteine und kommen in allen bekannten Lebensformen vor. Trotz ihrer vergleichsweise einfachen Struktur erfordert ihre Biosynthese und der Einbau in Apoproteine komplexe Synthesemaschinerien, die evolutionä...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2011
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Eisen-Schwefel-Cluster (Fe/S-Cluster) sind essentielle und vielseitige Kofaktoren zahlreicher Proteine und kommen in allen bekannten Lebensformen vor. Trotz ihrer vergleichsweise einfachen Struktur erfordert ihre Biosynthese und der Einbau in Apoproteine komplexe Synthesemaschinerien, die evolutionär konserviert sind. Im eukaryotischen Modellorganismus S. cerevisiae hängt die Biogenese mitochondrialer Fe/S-Proteine von der mitochondrialen ISC-Maschinerie ab, während die Synthese zytosolischer und nukleärer Fe/S-Proteine zusätzlich noch die mitochondriale ISC-Export- und die zytosolische CIA Maschinerie erfordert. Sowohl die Biosynthese mitochondrialer Fe/S-Proteine als auch die von zytosolischen oder nukleären Fe/S Proteinen kann in zwei biochemische Hauptreaktionen eingeteilt werden. Nach der de novo Assemblierung eines Fe/S Clusters auf einem Gerüstprotein wird der so vorgefertigte Cluster auf das eigentliche Zielprotein übertragen und dort inseriert. Während nahezu alle Komponenten der Biogenesemaschinerien mittlerweile bekannt sind, ist der molekulare Mechanismus der in vivo Fe/S-Cluster Biosynthese noch in vielen Punkten ungeklärt.
Für die de novo Assemblierung von Fe/S-Clustern auf dem Gerüstprotein Isu1 der mitochondrialen ISC-Maschinerie ist die Elektronenübertragung durch ein Ferredoxin essentiell. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich eukaryotische mitochondriale Ferredoxine funktionell und strukturell in drei Untergruppen aufteilen lassen. Während die Mitglieder der ersten Untergruppe wie humanes Ferredoxin Fdx2 spezifisch an der Fe/S-Cluster Biogenese und der Häm A Biosynthese beteiligt sind, liefern die Ferredoxine der zweiten Untergruppe wie das Fdx2-verwandte humane Ferredoxin Fdx1 Elektronen für die Steroidbiogenese durch Cytochrom P450 Enzyme (CYP). Die dritte Untergruppe bilden die noch vielseitigeren Ferredoxine aus Pilzen wie Yah1 aus S. cerevisiae, das neben den Funktionen des Fdx2 auch noch eine essentielle Rolle in der Biosynthese von Koenzym Q6 spielt. In dieser Arbeit wurde die Struktur des humanen Ferredoxins Fdx2 mit einer Auflösung von 1,7 Å durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Im Vergleich zur schon bekannten Struktur von Fdx1 besitzt Fdx2 eine nahezu identische Faltung. Strukturelle Unterschiede wurden nur in der α-Helix C sowie im Bereich nach α-Helix C gefunden. Dies warf die Frage nach der strukturellen Basis für die hohe Substratspezifität der beiden humanen Ferredoxine auf. Durch genetische und biochemische Experimente konnte gezeigt werden, dass der hoch konservierte C Terminus von Fdx2 essentiell für die in vivo Funktion des Proteins in der Biogenese von Fe/S-Clustern ist. Ein in der Fe/S-Cluster Biogenese funktionelles Fdx1 konnte durch die Übertragung der 27 C-terminalen Aminosäuren des Fdx2 an den Fdx1 C-Terminus erzeugt werden. Weitere Sequenzaustausche im Bereich der α Helix C sowie in der Fe/S-Cluster-bedeckenden Schlaufe erhöhten die Funktionsfähigkeit des Fdx1 in der Fe/S Proteinbiogenese, was die Rolle dieser Reste bei der Erzeugung der Substratspezifität nachweist. Umgekehrt gelang es, in Fdx2 eine Elektronenübertragungsfunktion auf CYP einzuführen. Die hierfür kritische Mutation wurde als R73E identifiziert. Die Umfunktionalisierung des Fdx2 war überraschenderweise nicht abhängig von der Sequenz am C Terminus. Da die Funktionsübertragung durch die R73E Mutation nur partiell erfolgte, scheint diese Schlüsselaminosäure nicht allein verantwortlich für die Spezifität von Fdx1 für CYP zu sein. Der positiv geladene Rest R73 im Fdx2 könnte daher eher verhindern, dass dieses Ferredoxin Elektronen auf CYP übertragen kann. Die theoretische Analyse des Dipolmomentes der Ferredoxine Fdx1 und Fdx2 ergab, dass die Dipolmomentvektoren der beiden Ferredoxine nahezu senkrecht zueinander stehen. Da die Interaktion der hochgeladenen Ferredoxine mit ihren Proteinpartnern auf Ladungswechselwirkungen beruht, deutet dieser Unterschied auf einen elektrostatischen Steuerungseffekt bei der Annäherung der Ferredoxine an den entsprechenden Elektronenakzeptor als mögliche Unterstützung der Funktionsspezifität hin. Ein solcher Steuerungseffekt könnte ein allgemeines Prinzip bei der Annäherung von Proteinen in transienten Elektronentransferkomplexen darstellen.
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| DOI: | 10.17192/z2011.0102 |