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Entwicklung eines amperometrischen Biosensors für Cyanid
Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines amperometrischen Biosensors für Cyanid unter Ausnutzung einer dreistufigen Reaktionskaskade mit Beteiligung von zwei Enzymen. In der ersten Stufe dieser Kaskade wird Cyanid bzw. dessen korrespondierende Säure Blausäure von Cyanidase (EC 3.5.5.1) zu Ammon...
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2010
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines amperometrischen Biosensors
für Cyanid unter Ausnutzung einer dreistufigen Reaktionskaskade mit
Beteiligung von zwei Enzymen. In der ersten Stufe dieser Kaskade wird
Cyanid bzw. dessen korrespondierende Säure Blausäure von Cyanidase
(EC 3.5.5.1) zu Ammoniak und Ameisensäure umgesetzt. Formiat als
korrespondierende Base der Ameisensäure wird anschließend von
Formiatdehydrogenase (EC 1.2.1.2) zu Kohlendioxid oxidiert, wobei NAD
als Cosubstrat zu NADH reduziert wird. Auf der dritten Stufe reagiert
die oxidierte Form eines Redoxmediators mit NADH und wird unter
Regeneration von NAD in die reduzierte Form überführt. Amperometrisch
quantifizierbar sind Formiat auf der ersten, NADH auf der zweiten
sowie die reduzierte Form des Mediators auf der dritten Stufe.
Technisch kamen zwei verschiedene Sensoraufbauten zum Einsatz. Zum
einen wurde ein Durchflusssystem benutzt, das aus einem
Injektionsventil, Enzymkartuschen und einer Durchflusszelle für
amperometrische Elektrodenchips bestand. Zum anderen wurden Messungen
in der Gasphase durchgeführt, wobei ein Elektrodenchip mit einer
Mischung aus den für die Kaskade benötigten Enzymen und Reagenzien
bedeckt und im Gasraum eines abgeschlossenen Gefäßes platziert wurde.
Am Boden des Gefäßes befand sich eine Säurekomponente, die nach Zugabe
von Proben darin enthaltenes Cyanid protonierte. In der Folge trat
Blausäure in den Gasraum über und gelangte zur Mischung auf dem
Elektrodenchip.
Formiat aus der ersten Stufe der Kaskade konnte nur durch
Platin-Arbeitselektroden detektiert werden. Im Durchflusssystem war
eine Kartusche mit immobilisierter Cyanidase jedoch nicht in der Lage,
das gesamte Cyanid umzusetzen. Das restliche Cyanid interferierte mit
der Platin-Elektrode und störte so die Messung. Ein Abfangen des nicht
hydrolysierten Cyanids durch Bildung von Metallkomplexen war nicht
erfolgreich.
Für die Bestimmung von Cyanid durch Detektion von NADH über ein
Durchflusssystem wurde eine Nachweisgrenze von 0,7 µM und eine
Bestimmungsgrenze von 2,4 µM ermittelt. Der lineare Bereich erstreckte
sich von der Bestimmungsgrenze bis zu 1 mM. Nitrile sowie Sulfid
störten die Messung nicht, Thiocyanat interferierte leicht. Es kann
allerdings davon ausgegangen werden, dass Formiat im Vergleich zu
Cyanid überproportional hohe Signale hervorruft. Messungen von
Realproben mit komplexen Matrices wie Pflanzenextrakten waren möglich.
Die Richtigkeit der ermittelten Cyanidkonzentrationen in Extrakten von
Kirschlorbeerblättern wurde mit der DIN-Methode 38405-13 überprüft,
wobei mit einer mittleren Abweichung von -4,8% eine gute
Übereinstimmung gefunden wurde. Weiterhin wurde eine gute
Langzeitstabilität des Aufbaus festgestellt. Nach mehr als drei
Monaten konnte noch kein Abfall der Sensitivität beobachtet werden.
Messungen im Gasraum erwiesen sich dagegen als problembehaftet.
Zugaben von cyanidfreien Flüssigkeiten in die Säurekomponente
verursachten Signale, die in vielen Fällen die gleiche Höhe wie
Signale cyanidhaltiger Proben erreichten. Ein starker Einfluss des
Wasserdampfdrucks auf das Signal wird vermutet. Lediglich bei Einsatz
des Mediators Meldolablau zusammen mit Graphit-Arbeitselektroden, also
unter Ausnutzung der vollständigen, dreistufigen Kaskade, konnten
cyanidfreie von cyanidhaltigen Proben im millimolaren
Konzentrationsbereich unterschieden werden. Die dabei im Gasraum
vorhandenen Blausäuremengen bewegten sich zwischen 2 und 800 ppm.
Weitere untersuchte Mediatoren wie Kaliumhexacyanidoferrat und
Benzochinonderivate erwiesen sich als weitgehend ungeeignet. Die
Signalhöhen waren jedoch auch mit Meldolablau als Mediator nur schwer
reproduzierbar. Zudem verschlechterte sich das Ansprechverhalten des
Sensors mit fortschreitender Messdauer. Die Orientierung des
Elektrodenchips im Gasraum nahm ebenfalls Einfluss auf den
Signalverlauf. Versuche, die Mischung auf dem Elektrodenchip zu
fixieren, verliefen unbefriedigend. Ebenso zeigten chemische und
elektrochemische Modifikationen der Arbeitselektrode wenig Erfolg.
Hier bedarf es weiterer Entwicklungsarbeit, um einen praktikablen
amperometrischen Gassensor nach dem vorgestellten Messprinzip zu
erhalten. Die dreistufige Reaktionskaskade scheint jedoch
grundsätzlich geeignet für Messungen im Gasraum. |
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| DOI: | 10.17192/z2010.0167 |