10.17192/z2010.0083
Samel, Stefan Andreas
Stefan Andreas
Samel
Arbeiten zur strukturellen Charakterisierung von Thioesterase-, Kondensations- und Epimerisierungsdomänen nichtribosomaler Peptidsynthetasen
Structural characterization of thioesterase, condensation and epimerization domains of nonribosomal peptide synthetases
Philipps-Universität Marburg
2009
Protein crystallography
Thioesterse domain
NRPS
Condensation domain
Epimerization domain
Proteinkristallographie
Epimerisierungsdomäne
X-ray
Biochemie
Nonribosomal peptide synthesis
NRPS
Nichtribosomale Peptidsynthese
Chemistry + allied sciences
Chemie
Thioesterasedomäne
Kondensatinsdomäne
Chemie
Essen, L.-O. (Prof. Dr.)
2011-08-10
2010-03-15
de
DoctoralThesis
https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2010/0083
urn:nbn:de:hebis:04-z2010-00832
https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2010/0083/cover.png
application/pdf
https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/
Nichtribosomal synthetisierte Peptide stellen eine breite Klasse von Naturstoffen dar und besitzen meist pharmakologisch nützliche Eigenschaften. Diese von Bakterien und Pilzen produzierten, niedermolekularen Peptidverbindungen enthalten meist modifizierte Reste, zum Teil Aryl- und
Fettsäuren und sind häufig makrozyklisiert. Die strukturelle Vielfalt wird durch die Ribosomenunabhängige Synthese an großen Enzymen bzw. Enzymkomplexen, den Nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS), möglich. Sie sind ähnlich den Typ I Fettsäuresynthasen modular aufgebaut, wobei definierte Domänen die erforderlichen Reaktionen katalysieren.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der strukturellen Aufklärung der Domänenstrukturen von Thioesterase-, Kondensations- und Epimerisierungsdomänen. Thioesterasedomänen liegen meist am Ende eines Syntheseclusters und katalysieren die Produktabspaltung. Dies geschieht häufig unter Makrozyklisierung des Produktpeptids. Kondensationsdomänen hingegen katalysieren die Ausbildung von Peptidbindungen in den Peptidprodukten. Epimerisierungsdomänen epimerisieren Aminosäurereste in den enzymgebundenen Intermediaten. In Synthetaseclustern sind
sie darüber hinaus an den intramolekularen Wechselwirkungen zur gegenseitigen Erkennung aufeinanderfolgender Synthetasen beteiligt.
Für die Thioesterase des Fengycin Syntheseclusters aus B. subtilis wurde durch Lösung ihrer Struktur bei 1.8 Å Auflösung und mit Hilfe computergestützter Methoden ein Strukturmodell eines Enzym-Produkt-Komplexes entwickelt. In diesem Komplex ist das Produkt edge-on in einer grabenförmigen Vertiefung der Proteinoberfläche gebunden. Die Stabilität des Komplexes konnte mit Hilfe einer Moleküldynamik-Simulation über einen Zeitraum von 10 ns gezeigt werden.
Anschließend durchgeführte Enzymaktivitätstests unter Verwendung gezielt veränderter Substratpeptide unterstützen das Modell des Enzym-Produkt-Komplexes.
Die 1.8 Å Struktur eines PCP-C Bidomänenproteins aus der Tyrocidin Synthetase TycC aus B. brevis wurde mittels multipler, anomaler Dispersion (MAD) gelöst. Sie liefert Einblick sowohl in die Struktur einer internen Kondensationsdomäne als auch in die Lage des Domänenverbindenden Linkers. Die beobachtete Konformation der Peptidyl Carrier Protein-Domäne entspricht der A/H-Konformation. Die Kondensationsdomäne besteht aus zwei Subdomänen, die
jeweils Ähnlichkeit zum Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Faltungstyp aufweisen. An der Grenzfläche der Subdomänen liegen sowohl das katalytische Zentrum als auch zwei Bereiche, über die die beiden Subdomänen miteinander interagieren. Dies sind zum einen die bridge region, die das aktive Zentrum überbrückt, zum anderen der floor loop, der den Boden des aktiven Zentrums
bildet und dessen Wechselwirkungen zur strukturellen Integrität des aktiven Zentrums beitragen.
Der Mechanismus der Kondensationsreaktion ist noch nicht vollständig geklärt. Strukturbasierte Berechnungen deuten darauf hin, dass, entgegen der bisherigen Modellvorstellung, der Histidinrest im aktiven Zentrum nicht als katalytische Base agiert. Auf Basis weiterer in der Kristallstruktur beobachteter Wechselwirkungen wird ein neues Modell für die Katalyse der Peptidbindungsbildung in Kondensationsdomänen vorgeschlagen.
Die strukturelle Charakterisierung der NRPS-Epimerisierungsdomäne der Tyrocidin Synthetase TycA aus B. brevis bei 1.65 Å Auflösung gibt erstmals Einblicke in die räumliche Organisation dieser Kofaktor-unabhängigen Epimerasen. Bedingt durch die Verwandtschaft mit den Kondensationsdomänen bestehen die Epimerisierungsdomänen ebenfalls aus zwei CAT-ähnlichen Subdomänen. Ein Vergleich mit der oben beschriebenen Kondensationsdomäne zeigt auch deutliche Unterschiede im Bereich der bridge region, des floor loops sowie im aktiven Zentrum.
Die Epimerisierungsdomäne enthält in ihrem aktiven Zentrum neben einem konservierten, katalytisch aktiven Histidinrest, H146, ebenfalls einen konservierten Glutamatrest, E285. Auch für die Epimerisierungsdomäne ergeben die Berechnungen der Protonierungszustände, dass H146 protoniert vorliegt. Dies widerspricht den bisherigen Modellvorstellungen, wonach H146 als
katalytische Base auftritt. Während der Mechanismus ungeklärt bleibt, wird die Epimerisierungsdomäne mit strukturell und funktionell ähnlichen Proteinen verglichen, um Hinweise auf den Katalysemechanismus zu erhalten.