Charakterisierung neuer Interaktionspartner der NFAT-vermittelten Transkription im Pankreaskarzinom
Malsy, Manuela
Die nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFATs) wurden vor allem in der Regulierung der Immunantwort charakterisiert, wo sie in der Induktion der Genübertragung als Transkriptionsfaktoren eine entscheidende Rolle spielen (Rao et al. 1997). In den letzten Jahren wurden NFAT-Proteine nicht nur in T-Zellen, sondern auch in anderen Zellen außerhalb des Immunsystems beobachtet, wo sie die Expression zentraler Gene der Differenzierung und des Wachstums kontrollieren (Viola et al. 2004). So werden sie u.a. auch in Pankreaskarzinomzellen (Buchholz et al. 2006) exprimiert. NFAT-Proteine sind primär zytoplasmatisch lokalisiert und translozieren erst nach Aktivierung in den Zellkern. Dort interagieren sie mit anderen Bindungspartnern an der DNA (Hogan et al. 2003). Es handelt sich hierbei um Transkriptionsfaktoren, die mit NFAT-Proteinen kooperieren und so die Selektion und Regulierung NFAT-kontrollierter Gene beeinflussen. Die vorliegende Arbeit fokussiert auf NFATc2, welches zwar eine hohe Expressionsintensität im Pankreaskarzinom aufweist, dessen Funktion und DNA-regulierenden Eigenschaften hier jedoch unbekannt sind. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, mögliche Interaktions-partner des Transkriptionsfaktors NFATc2 in Pankreaskarzinomzellen zu identifizieren und zu kennzeichnen.
Zunächst wird in Vorarbeiten die Expression von NFATc2 und potentieller Partnerproteine, die bereits in der Literatur in anderen Zellarten und Geweben beschrieben werden und zusätzlich die Kriterien einer Calcium-abhängigen Regulierung und einer nachgewiesenen onkogenen Wirkung im Organismus erfüllen, in einer Reihe etablierter Pankreaskarzinomzelllinien untersucht und bestätigt. Ebenso wird Ionomycin, ein Stimulans, gewählt, um eine zuverlässige Translokation von NFATc2 in den Zellkern durch Aktivierung des Calcium-Calcineurin-Signalwegs zu garantieren. Nachteil dieses Stimulus ist seine Zelltoxizität, die eine Verwendung für Langzeitexperimente ausschließt. Die Wirkungsweise von Ionomycin wird durch die Immunfluoreszenzstudie, sowie auf Proteinebene durch Western Blot dargelegt.
In ersten Interaktionsversuchen mittels Immunpräzipitation zeigt sich eine Bindung von NFATc2 mit dem Transkriptionsfaktor Sp1. Zur Verifizierung und Charakterisierung der hier beschriebenen Interaktion zwischen NFATc2 und Sp1 bezüglich des Zeitintervalls werden weitere Methoden angewandt. In der Immunfluoreszenzstudie ist eine Kolokalisation der onkogenen Transkriptions-faktoren Sp1 und NFATc2 in Pankreaskarzinomzellen unter Ionomycin-stimulation zu erkennen. Weiterführend wird gezeigt, dass die Transkriptions-faktoren im selben Immunkomplex an der NFAT-Targetsequenz GGAAA in direkte Wechselwirkung treten und Sp1 die funktionelle Aktivität seines Bindungspartners an dem NFAT-responsiven Promotorkonstrukt steigert. Diese Interaktion wird durch Ionomycin in der frühen Phase der Stimulation (bis 60 min) begünstigt.
Im zweiten Teil der Arbeit wird die physikalische Interaktion von NFATc2 und Sp1 anhand von Sp1-Deletionsmutanten näher charakterisiert. Dabei kann sowohl auf physikalischer Ebene, mittels Immunpräzipitation, als auch auf funktionaler Ebene mittels Luziferase-Assay gezeigt werden, dass der N-Terminus von Sp1 mit dem Transkriptionsfaktor NFATc2 interagiert und beide Faktoren gemeinsam die Funktion ihrer Zielgene regulieren.
Mittels Expressionsprofilanalyse werden im dritten Teil dieser Arbeit einige interessante Zielgene von NFATc2 und Sp1, die nach Ionomycinbehandlung differentiell exprimiert werden, identifiziert. Darunter finden sich das Proto-onkogen c-Fos, der Tumornekrosefaktor TNF-alpha sowie das Adhäsions-molekül Integrin-β-3. Wird Sp1 durch siRNA-Technologie gehemmt, findet sich bei c-Fos und TNF-alpha ein abgeschwächter Ionomycineffekt, sodass die DNA-Bindungsaktivität von Sp1-artigen Transkriptionsfaktoren für die NFATc2-vermittelte Regulation dieser Gene von Bedeutung sein muss. Diese Beobachtung wird in unabhängigen Untersuchungen stellvertretend für c-Fos durch qRT-PCR und dessen funktionelle Bedeutung für die Pankreas-karzinomzelle mittels Thymidin-Proliferations-Assay dargelegt. Als Ergebnis kann eine verminderte Zellproliferation, sowohl nach 24 h als auch nach 48 h bei Knockdown von beiden Transkriptionsfaktoren, beobachtet werden.
Schlussfolgernd besteht die Vermutung, dass die Bindungspartner NFATc2 und Sp1 im Pankreaskarzinom interagieren und gemeinsam Zielgene, die für das Zellwachstum verantwortlich sind, regulieren. Der Verlust bereits eines Transkriptionsfaktors verhindert die onkogene Komplexbildung und die Expression möglicher zellzyklusregulierender Gene.
Philipps-Universität Marburg
Medical sciences Medicine
urn:nbn:de:hebis:04-z2009-07801
https://doi.org/10.17192/z2009.0780
opus:2571
Pankreaskarzinom
urn:nbn:de:hebis:04-z2009-07801
The nuclear factors of activated T-cells (NFATs) were mainly characterized by the regulation of the immune response, in which they play an essential role as transcription factors (Rao et al. 1997). In recent years it has been reported that expression of NFAT-protein is not only restricted to T-cells, but can also be found in a number of cells outside the immune system, in which they control the expression of genes that regulate differentiation and growth (Viola et al. 2004). Pancreatic cells are shown to express NFAT (Buchholz et al. 2006). NFAT-proteins are primarily located in the cytoplasm and only translocate to the nucleus after activation. There in place they interact with other binding partners on the DNA (Hogan et al. 2003). Those binding partners are transcription factors that co-operate with NFAT to influence the selection and regulation of NFAT-controlled genes. This study focuses on NFATc2, which is highly expressed in pancreatic carcinomas. However, its abilities to regulate DNA remains elusive and is not investigated in detail.
The aim of this study is to identify possible binding partners of NFATc2 in pancreatic carcinoma cells.
In the first part of this study the expression of NFAT and its potential binding partners is analyzed in a number of established pancreatic carcinoma cell-lines. To find potential binding partners of NFATc2, a literature search is performed for transcription factors that have already been shown to interact with NFATc2 in other cell types and tissues. In addition they have to be calcium-regulated and known for their oncogenic potential. Ionomycin, is a stimulant that guarantees the translocation of NFATc2 into the nucleus by activating the calcium-calcineurin-signaling pathway. However, Ionomycin exerts cytotoxic effects are making long term stimulations impossible. The process describe above is proven by using immunofluorescence studies as well as western blot analysis.
In the following experiments, using immunoprecipitation, a binding of NFATc2 with the transcription factor Sp1 is observed. To verify and characterize this interaction additional experiments are performed. Using immunofluorescence labeling a colocalization of the oncogenic transcriptions factors Sp1 and NFATc2 can be seen in pancreatic carcinoma cell-lines in the presents of Ionomycin. In additional studies it is shown that they interact in the same complex at the NFAT-target sequence GGAAA. Sp1 increases the activity of its binding partner at the NFAT-responsive promoter construct. This interaction intensifies with the presence of Ionomycin in the early phase of stimulation (+amp;lt; 60 min).
In the second part of this study the physical interaction of NFATc2 and Sp1 is characterized in more detail using mutants with Sp1-deletions. Here, it is shown on multiple levels using immunoprecipitation and luciferase-assays that the N-terminus of Sp1 interacts with NFATc2 to control the function of their target genes.
Thru gene expression analysis some really interesting target genes of NFATc2 and Sp1, which are expressed thru Ionomycin treatment, are identified in the third part of the study. Among them, the proto-oncogene c-fos, tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and the adhesion molecule integrin-β-3 are found. The knock-down of Sp1 using siRNA, decreases the effects of Ionomycin on c-fos and TNF-alpha, indicating that the DNA-binding activity of Sp1 has relevancy in promoting the NFATc2 regulation of these genes. This observation and its relevance for pancreatic cancer is confirmed in independent experiments for c-fos using qRT-PCR and thymdine-proliferation-assay. A decreased cell proliferation is observed after 24 and 48 hours following knock-down of both transcription factors.
In summary it can be presumed that NFATc2 and Sp1 interact in pancreatic carcinoma cells and form a complex that regulates target genes that control cell proliferation. The loss of either one of the two transcription factors inhibits the formation of this complex and its downstream regulation of cell cycle regulating genes.
Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg
Universitätsbibliothek Marburg
https://doi.org/10.17192/z2009.0780
Pancreatic cancer
NFAT
Sp1
Innere Medizin
113
application/pdf
NFAT
Medizin
2009-12-15
monograph
Charakterisierung neuer Interaktionspartner der NFAT-vermittelten Transkription im Pankreaskarzinom
doctoralThesis
Malsy, Manuela
Malsy
Manuela
ths
Dr.
Ellenrieder
Volker
Ellenrieder, Volker (Dr.)
Die nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFATs) wurden vor allem in der Regulierung der Immunantwort charakterisiert, wo sie in der Induktion der Genübertragung als Transkriptionsfaktoren eine entscheidende Rolle spielen (Rao et al. 1997). In den letzten Jahren wurden NFAT-Proteine nicht nur in T-Zellen, sondern auch in anderen Zellen außerhalb des Immunsystems beobachtet, wo sie die Expression zentraler Gene der Differenzierung und des Wachstums kontrollieren (Viola et al. 2004). So werden sie u.a. auch in Pankreaskarzinomzellen (Buchholz et al. 2006) exprimiert. NFAT-Proteine sind primär zytoplasmatisch lokalisiert und translozieren erst nach Aktivierung in den Zellkern. Dort interagieren sie mit anderen Bindungspartnern an der DNA (Hogan et al. 2003). Es handelt sich hierbei um Transkriptionsfaktoren, die mit NFAT-Proteinen kooperieren und so die Selektion und Regulierung NFAT-kontrollierter Gene beeinflussen. Die vorliegende Arbeit fokussiert auf NFATc2, welches zwar eine hohe Expressionsintensität im Pankreaskarzinom aufweist, dessen Funktion und DNA-regulierenden Eigenschaften hier jedoch unbekannt sind. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, mögliche Interaktions-partner des Transkriptionsfaktors NFATc2 in Pankreaskarzinomzellen zu identifizieren und zu kennzeichnen.
Zunächst wird in Vorarbeiten die Expression von NFATc2 und potentieller Partnerproteine, die bereits in der Literatur in anderen Zellarten und Geweben beschrieben werden und zusätzlich die Kriterien einer Calcium-abhängigen Regulierung und einer nachgewiesenen onkogenen Wirkung im Organismus erfüllen, in einer Reihe etablierter Pankreaskarzinomzelllinien untersucht und bestätigt. Ebenso wird Ionomycin, ein Stimulans, gewählt, um eine zuverlässige Translokation von NFATc2 in den Zellkern durch Aktivierung des Calcium-Calcineurin-Signalwegs zu garantieren. Nachteil dieses Stimulus ist seine Zelltoxizität, die eine Verwendung für Langzeitexperimente ausschließt. Die Wirkungsweise von Ionomycin wird durch die Immunfluoreszenzstudie, sowie auf Proteinebene durch Western Blot dargelegt.
In ersten Interaktionsversuchen mittels Immunpräzipitation zeigt sich eine Bindung von NFATc2 mit dem Transkriptionsfaktor Sp1. Zur Verifizierung und Charakterisierung der hier beschriebenen Interaktion zwischen NFATc2 und Sp1 bezüglich des Zeitintervalls werden weitere Methoden angewandt. In der Immunfluoreszenzstudie ist eine Kolokalisation der onkogenen Transkriptions-faktoren Sp1 und NFATc2 in Pankreaskarzinomzellen unter Ionomycin-stimulation zu erkennen. Weiterführend wird gezeigt, dass die Transkriptions-faktoren im selben Immunkomplex an der NFAT-Targetsequenz GGAAA in direkte Wechselwirkung treten und Sp1 die funktionelle Aktivität seines Bindungspartners an dem NFAT-responsiven Promotorkonstrukt steigert. Diese Interaktion wird durch Ionomycin in der frühen Phase der Stimulation (bis 60 min) begünstigt.
Im zweiten Teil der Arbeit wird die physikalische Interaktion von NFATc2 und Sp1 anhand von Sp1-Deletionsmutanten näher charakterisiert. Dabei kann sowohl auf physikalischer Ebene, mittels Immunpräzipitation, als auch auf funktionaler Ebene mittels Luziferase-Assay gezeigt werden, dass der N-Terminus von Sp1 mit dem Transkriptionsfaktor NFATc2 interagiert und beide Faktoren gemeinsam die Funktion ihrer Zielgene regulieren.
Mittels Expressionsprofilanalyse werden im dritten Teil dieser Arbeit einige interessante Zielgene von NFATc2 und Sp1, die nach Ionomycinbehandlung differentiell exprimiert werden, identifiziert. Darunter finden sich das Proto-onkogen c-Fos, der Tumornekrosefaktor TNF-alpha sowie das Adhäsions-molekül Integrin-β-3. Wird Sp1 durch siRNA-Technologie gehemmt, findet sich bei c-Fos und TNF-alpha ein abgeschwächter Ionomycineffekt, sodass die DNA-Bindungsaktivität von Sp1-artigen Transkriptionsfaktoren für die NFATc2-vermittelte Regulation dieser Gene von Bedeutung sein muss. Diese Beobachtung wird in unabhängigen Untersuchungen stellvertretend für c-Fos durch qRT-PCR und dessen funktionelle Bedeutung für die Pankreas-karzinomzelle mittels Thymidin-Proliferations-Assay dargelegt. Als Ergebnis kann eine verminderte Zellproliferation, sowohl nach 24 h als auch nach 48 h bei Knockdown von beiden Transkriptionsfaktoren, beobachtet werden.
Schlussfolgernd besteht die Vermutung, dass die Bindungspartner NFATc2 und Sp1 im Pankreaskarzinom interagieren und gemeinsam Zielgene, die für das Zellwachstum verantwortlich sind, regulieren. Der Verlust bereits eines Transkriptionsfaktors verhindert die onkogene Komplexbildung und die Expression möglicher zellzyklusregulierender Gene.
2010-01-26
https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2009/0780/cover.png
opus:2571
2009
German
Sp1
2011-08-10
Medical sciences Medicine
Medizin
Philipps-Universität Marburg
Characterisation of new cooperating partners of NFAT-regulated transcription in pancreatic cancer
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