Localization and Functional Analysis of the Calcium Permeable Melastatin-like Channel TRPM3

TRPM3 ist das Gen für einen hochkonservierten melastatinähnlichen transient receptor Kanal mit direkten Orthologen in allen Chordatieren und eng verwandten Homologen in allen Bilateralia. Bisher ist nur wenig über seine biologische Rolle, Aktivierungsmechanismen, sein Expressionsmuster und die funktionelle Rolle seiner Domänen bekannt. Das Ziel dieser Arbeit ist, die cDNA von mTRPM3 zu klonieren, im in vitro-Modell Überzuexprimieren und zu untersuchen. Es sollen Antikörper gegen mTRPM3 hergestellt werden, um sein Expressionsprofil in der Maus zu bestimmen. Schließlich soll anhand eines Knockout-Allels in der Maus die biologische Rolle von TRPM3 beurteilt werden. 1. Es wurden zwei cDNAs von mTRPM3 kloniert. Beide beginnen mit einem Start-Exon, das wir in einer 5-RACE-Studie identifiziert hatten. Eine Variante war 1337 Aminosäurereste lang und hat eine kürzere C-terminale Domäne als die andere, welche 1719 Aminosäuren hat. Beide Spleivarianten waren in HEK293-Zellen exprimierbar und wurden in den basolateralen Kompartimenten diferenzierter MDCK-Zellen, die TRPM3 stabil induzierbar exprimiert, identifiziert. In HEK-293 Zellen überexprimiert, war der Kanal nicht aktivierbar durch hypo- oder hyperosmolare Stimuli, D-erythro-Sphingosin und Entleerung intrazellulärer Calciumspeicher zur Hemmung Kalzium-Einstroms. Stattdessen war bei beiden Spleißvarianten ein starker konstitutiver Kalzium-Einstrom durch TRPM3 zu beobachten, der durch inaktievierte Punktmutationen in der Porendomäne unterdrückt werden konnte. 2. Durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) und Koimmunopräzipitation wurde gezeigt, dass TRPM3 einen multimeren Kanal-Komplex bildet. Es wurde festgestellt, dass der C-Terminus von TRPM3 an der Plasmamembran durch Palmitoylierung eines Cystein-Motivs verankert ist. Die Palmitoylierung hat Auswirkungen auf das Ausmaß des Kalzium-Einstroms durch TRPM3. Mittels eines yeast two hybrid screens wurden neue Bindungspartner des C-Terminus von TRPM3 aus einer Nieren-cDNA Bibliothek ermittelt, darunter der alpha-B Cristallin und der Protein-Kinase-Inhibitor gamma (PKIG). 3. Das Expressionsmuster von TRPM3 wurde durch eine Kombination von Northern Blots, Western Blots und lacZ-Färbungen in einem Mausmodell untersucht, das eine GenTrap-Insertion im TRPM-Gen besitzt. Es wurde gefunden, dass TRPM3 überwiegend im Auge und Gehirn exprimiert ist. Im Gegensatz zu humanen TRPM3 hat Mause-TRPM3 ein niedrigeres Expressionsniveau in Niere. Fein strukturell wurde TRPM3 anhand von lacZ Färbung von Kryostatschnitten vor allem in sensorischen Zelle wie den Bipolar- und Ganglion-Zellen des Auges, der embryonalen Ohr-Blase sowie den Spinalganglien festgestellt. Im Gehirn war eine hohe TRPM3-Expression zu sehen, vor allem in den Neuronen-Populationen der Hippocampusformation (Gyrus dentatus, CA1, CA3), der Purkinje-Zellschicht des Cerebellums und dem Neocortex. Insgesamt ist TRPM3 vor allem in Zellen ektodermalen Ursprungs exprimiert. 4. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Mausmodell charakterisiert, in dem das TRPM3-Gen durch eine GenTrap-Insertion inaktiviert wurde. Die Insertion wurde mittels PCR bestätigt. Western Blot Analysen mit spezifischem Antikörper bestätigte die Abwesenheit des TRPM3-Proteins im murinen Auge. Der genetische Hintergrund der Hautfarbe wurde mittels Rückkreuzung isogenisiert. Grundlegende Experimenten zum Phänotyp von TRPM3-/- Mäuse zeigten die Abwesenheit von morphologischen und verhaltensbedingten Defekten. Die TRPM3-/- Mäuse waren uneingeschränkt lebensfähig. Weitere Untersuchungen der visuellen Fähigkeiten der TRPM3-/- Mäuse zeigten keine Anzeichen von visueller Beeinträchtigung. Zusammenfassend können wir mit den klonierten TRPM3 cDNAs feststellen, dass TRPM3 Kalzium permeabel und konstitutiv aktiv ist. TRPM3 ist C-terminel palmitoyliert und interagiert mit einer Vielzahl von Proteinen, die mittels yeast two hybrid screen identifiziert worden sind. TRPM3 ist stark in sensorischen Geweben und dem zentralen Nervensystem angereichert. Die TRPM3-/- Mäuse sind ohne größere neurologische oder sensorische Einschränkungen lebensfähig.