Methoden zur Evaluation des neuronalen Zelltods in hippokampalen und kortikalen Primärkulturen der Ratte
Karayilan, Anne
Die große medizinische und ökonomische Bedeutung des Schlaganfalls hat in den vergangenen Jahren zu intensiver Forschung geführt. Die verzögerte Neurodegeneration, wie sie in der Penumbra abläuft, stellt einen viel versprechenden Ansatz zur neuroprotektiven Therapie dar. Hier laufen nach dem ischämischen Ereignis neurodegenerative Prozesse ab, auf die pharmakologisch Einfluss genommen werden kann und die zu einer Prognoseverbesserung dieses Krankheitsbildes führen können (Lo, 2003).
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Vergleichbarkeit von einander abweichender Labormethoden zur Bestimmung der Zellschädigung. Von besonderem Interesse war eine Vereinfachung der quantitativen Auswertung des Zelltods in neuronalen Zellkulturen anhand der photometrischen Messung. Ein weiterer Schwerpunkt war die Untersuchung der Zellschädigung und die Neuroprotektion unterschiedlicher Substanzen unter den Bedingungen des Sauerstoff-Glukose-Entzugs.
Eine mit dem Farbstoff Trypanblau gefärbte Nervenzellkultur wurde bei Wellenlängen von 570 und 590 nm photometrisch vermessen, was keinen signifikanten Unterschied ergab. Auch die Zellschädigung von acht und dreizehn Tage alten Zellkulturen zeigte vergleichbare Ergebnisse. Daraus lässt sich herleiten, dass Ergebnisse, die auf methodischen Unterschieden, wie das Alter der Kultur oder verschiedene Wellenlängenbereiche bei einer photometrischen Auswertung basieren, sehr gut vergleichbar sind. Beim Vergleich der photometrischen Messung mit der Auszählung einer Zellkultur zeigten sich ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Methoden. Jedoch war die Streuung der durch photometrische Messung ermittelten Ergebnisse deutlich größer als bei der Auszählung. Bei Methoden, die eine höhere Ungenauigkeit erwarten lassen, wie die photometrische Messung, sollte das bei der Planung der Versuche, zum Beispiel durch eine höhere Zahl der Einzelversuche, mit in Betracht gezogen werden. Hinsichtlich der Schädigung durch Glutamat war in der vorliegenden Arbeit weniger die Konzentration, als die Dauer der Einwirkung für das Ausmaß der Schädigung der Neurone ausschlaggebend. Dieser Faktor sollte beim Vergleich von Ergebnissen annähernd gleich sein. Die Substanz Dizocilpin führte bei Glutamatschädigung zu einer signifikanten Reduktion des Zellschadens. Auch bei der Schädigung durch NMDA war die Substanz neuroprotektiv wirksam. Das zeigt, dass Dizocilpin im Rahmen einer exzitotoxischen Zellschädigung über die Blockade der NMDA-Rezeptoren signifikant neuroprotektiv wirksam ist.
Um die Wirksamkeit von neuroprotektiven Substanzen unter den Bedingungen einer ischämischen Zellschädigung in der Nervenzellkultur beurteilen zu können, wurde das Modell des Sauerstoff-Glukose-Entzugs näher untersucht. Neuroprotektive Substanzen, die sich im Tiermodell als wirksam erwiesen hatten (Culmsee et al., 2001, 2004), erreichten auch unter den Bedingungen des Sauerstoff-Glukose-Entzugs eine Reduktion des Zellschadens. So kam es unter dem Einfluss von Pifithrin unter diesen Bedingungen zu einer signifikanten Reduktion an geschädigten Zellen. Memantine und Clenbuterol zeigten in der vorliegenden Arbeit keinen stark schützenden Effekt. Zum einen könnte das durch die zu kurze Vorbehandlungszeit von nur einer Stunde, zum anderen durch die hohe Grundschädigung und die verhältnismäßig schwache Schädigung durch Sauerstoff-Glukose-Entzug bedingt sein. Als Ursache für den hohen Grundschaden kommen unterschiedliche Präparationsbedingungen und die Verwendung unterschiedlicher Zellkulturen in Frage. Die schwache Schädigung könnte durch eine Hypothermie der Zellkulturen während der langen Behandlung oder durch einen unzureichenden Sauerstoffentzug verursacht sein. Es handelt sich beim Sauerstoff-Glukose-Entzug um ein etabliertes Modell, das unter kontrollierten Bedingungen Aufschluss über die ischämische Zellschädigung geben kann. Es ist jedoch sinnvoll auf gleiche Präparationsbedingungen und Zellkulturen zu achten und die Temperatur und den Sauerstoffgehalt in den Kulturen unter den Bedingungen des Sauerstoff-Glukose-Entzugs zu ermitteln, um solche Nebeneffekte sicher auszuschließen.
Philipps-Universität Marburg
Medical sciences Medicine
opus:2462
urn:nbn:de:hebis:04-z2009-05817
https://doi.org/10.17192/z2009.0581
https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2009/0581/cover.png
Nekrose
Apoptosis
Philipps-Universität Marburg
opus:2462
Necrosis
German
urn:nbn:de:hebis:04-z2009-05817
Medical sciences Medicine
Medizin
2009
Neuroprotectants
Großhirnrinde
https://doi.org/10.17192/z2009.0581
ppn:216671906
2011-08-10
Fachbereich Pharmazie
74
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Photometrie
Neuroprotektion
Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg
Universitätsbibliothek Marburg
Methoden zur Evaluation des neuronalen Zelltods in hippokampalen und kortikalen Primärkulturen der Ratte
Karayilan, Anne
Karayilan
Anne
Zelltod
Die große medizinische und ökonomische Bedeutung des Schlaganfalls hat in den vergangenen Jahren zu intensiver Forschung geführt. Die verzögerte Neurodegeneration, wie sie in der Penumbra abläuft, stellt einen viel versprechenden Ansatz zur neuroprotektiven Therapie dar. Hier laufen nach dem ischämischen Ereignis neurodegenerative Prozesse ab, auf die pharmakologisch Einfluss genommen werden kann und die zu einer Prognoseverbesserung dieses Krankheitsbildes führen können (Lo, 2003).
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Vergleichbarkeit von einander abweichender Labormethoden zur Bestimmung der Zellschädigung. Von besonderem Interesse war eine Vereinfachung der quantitativen Auswertung des Zelltods in neuronalen Zellkulturen anhand der photometrischen Messung. Ein weiterer Schwerpunkt war die Untersuchung der Zellschädigung und die Neuroprotektion unterschiedlicher Substanzen unter den Bedingungen des Sauerstoff-Glukose-Entzugs.
Eine mit dem Farbstoff Trypanblau gefärbte Nervenzellkultur wurde bei Wellenlängen von 570 und 590 nm photometrisch vermessen, was keinen signifikanten Unterschied ergab. Auch die Zellschädigung von acht und dreizehn Tage alten Zellkulturen zeigte vergleichbare Ergebnisse. Daraus lässt sich herleiten, dass Ergebnisse, die auf methodischen Unterschieden, wie das Alter der Kultur oder verschiedene Wellenlängenbereiche bei einer photometrischen Auswertung basieren, sehr gut vergleichbar sind. Beim Vergleich der photometrischen Messung mit der Auszählung einer Zellkultur zeigten sich ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Methoden. Jedoch war die Streuung der durch photometrische Messung ermittelten Ergebnisse deutlich größer als bei der Auszählung. Bei Methoden, die eine höhere Ungenauigkeit erwarten lassen, wie die photometrische Messung, sollte das bei der Planung der Versuche, zum Beispiel durch eine höhere Zahl der Einzelversuche, mit in Betracht gezogen werden. Hinsichtlich der Schädigung durch Glutamat war in der vorliegenden Arbeit weniger die Konzentration, als die Dauer der Einwirkung für das Ausmaß der Schädigung der Neurone ausschlaggebend. Dieser Faktor sollte beim Vergleich von Ergebnissen annähernd gleich sein. Die Substanz Dizocilpin führte bei Glutamatschädigung zu einer signifikanten Reduktion des Zellschadens. Auch bei der Schädigung durch NMDA war die Substanz neuroprotektiv wirksam. Das zeigt, dass Dizocilpin im Rahmen einer exzitotoxischen Zellschädigung über die Blockade der NMDA-Rezeptoren signifikant neuroprotektiv wirksam ist.
Um die Wirksamkeit von neuroprotektiven Substanzen unter den Bedingungen einer ischämischen Zellschädigung in der Nervenzellkultur beurteilen zu können, wurde das Modell des Sauerstoff-Glukose-Entzugs näher untersucht. Neuroprotektive Substanzen, die sich im Tiermodell als wirksam erwiesen hatten (Culmsee et al., 2001, 2004), erreichten auch unter den Bedingungen des Sauerstoff-Glukose-Entzugs eine Reduktion des Zellschadens. So kam es unter dem Einfluss von Pifithrin unter diesen Bedingungen zu einer signifikanten Reduktion an geschädigten Zellen. Memantine und Clenbuterol zeigten in der vorliegenden Arbeit keinen stark schützenden Effekt. Zum einen könnte das durch die zu kurze Vorbehandlungszeit von nur einer Stunde, zum anderen durch die hohe Grundschädigung und die verhältnismäßig schwache Schädigung durch Sauerstoff-Glukose-Entzug bedingt sein. Als Ursache für den hohen Grundschaden kommen unterschiedliche Präparationsbedingungen und die Verwendung unterschiedlicher Zellkulturen in Frage. Die schwache Schädigung könnte durch eine Hypothermie der Zellkulturen während der langen Behandlung oder durch einen unzureichenden Sauerstoffentzug verursacht sein. Es handelt sich beim Sauerstoff-Glukose-Entzug um ein etabliertes Modell, das unter kontrollierten Bedingungen Aufschluss über die ischämische Zellschädigung geben kann. Es ist jedoch sinnvoll auf gleiche Präparationsbedingungen und Zellkulturen zu achten und die Temperatur und den Sauerstoffgehalt in den Kulturen unter den Bedingungen des Sauerstoff-Glukose-Entzugs zu ermitteln, um solche Nebeneffekte sicher auszuschließen.
Apoptosis
2009-07-27
The important medical and economic interest of apoplectic stroke resulted in intensive research over the past years. The delayed neurodegeneration, which proceeds in the penumbra, is a promising approach for the neuroprotective therapy. After the ischemic occurrence neurodegenerative processes proceed in this place, which can be affected pharmacological and may result in an advancement of prognosis (Lo, 2003).
A focal point of this study was the investigation of comparability of aberrant laboratory techniques for the identification of the cell damage. A main interest was the simplification of the quantitative analysis of neuronal cell cultures with the photometric measurement. A further focal point was the investigation of the cell damage and the neuroprotective effect of diverse substances under the conditions of oxygen-glucose-deprivation.
A trypanblue stained neuronal cell culture was analysed photometric, which showed, that there was no significant difference between 570 and 590 nm. There was also no significant difference between the cell damage of eight and thirteen day old cell cultures. Thus it appears that results, which base upon methodical differences, like the age of the cell culture or different wavelengths of photometric analysis, are very well comparable. Also by comparing the photometric measurement and the enumeration of a cell culture there were no significant differences between the methods. However the scatter of the results, which were detected with the photometric measurement, was considerably greater than the scatter of the results of enumeration. If methods are used, which give rise to expectations for a higher impreciseness, like the photometric measurement, it should be considered in the design of an experiment, for instance by increasing the number of trials. Concerning the damage caused by glutamate in this study the concentration was less deciding for the cell damage than the duration of exposure. This criterion should be approximate the same, when considering results. The substance Dizocilpin resulted in significant reduction of the cell damage under glutamate exposure. Also under NMDA exposure the substance affected neuroprotective. That shows, that Dizocilpin acts significant neuroprotective caused by blockade of the NMDA-receptors in line with excitatory cell damage.
To appraise the efficacy of neuroprotective substances under ischemic conditions in cell culture, the model of oxygen-glucose-deprivation was more exacting analysed. Neuroprotective substances, which proved to be effective in the animal model (Culmsee et al., 2001, 2004), achieved also a reduction of the cell damage under the conditions of oxygen-glucose-deprivation. So in this study Pifithrin achieved a significant reduction of cell damage under these conditions. Memantine and Clenbuterol showed no intense protective effect in this study. On the one hand it could be caused by the short time of pre-treatment of only one hour, on the other hand it could be caused by the high basic-damage and the comparative low damage caused by oxygen-glucose-deprivation. The reason for the high basic-damage could be the different conditions of preparation and the usage of different cell cultures. The low damage could be caused by hypothermia of the cell cultures during the long period of treatment or by a deficient oxygen-deprivation. The model of oxygen-glucose-deprivation is an established model, which is able to give information about the ischemic cell damage under controlled conditions. However it is expedient to mind the same conditions of preparation and cell cultures and to detect the temperature and the oxygen content of the cultures under the conditions of oxygen-glucosedeprivation to eliminate such side effects.
ths
Prof. Dr. Dr.
Krieglstein
Josef
Krieglstein, Josef (Prof. Dr. Dr.)
Hippocampus
Schlaganfall
Hippocampus
2009-10-08
monograph
Sauerstoff-Glukoseentzug
Cerebral cortex
doctoralThesis
Methods for Evaluation of Neuronal Cell Death in Hippocampal and Cortical Primary Cultures of the Rat
Pharmakologie und Toxikologie
PRESERVATION_MASTER
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