TGT a Drug Target to Study pKa Shifts, Residual Solvation & Protein-Protein Interface Formation

In this thesis multiple computer aided methods of structure based drug design along with X-ray crystallography and kinetic measurements were used to investigate inhibitors of tRNA-guanine transglycosylase (TGT) a putative target for a new specific antibiotic against Shigella bacteria. Within a year...

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Main Author: Ritschel, Tina
Contributors: Klebe, Gerhard (Prof., Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
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Im Rahmen dieser Dissertation sind diverse Methoden des computergestützten, strukturbasierten Wirkstoffdesigns in Kombination mit röntgenkristallographischen Methoden und kinetische Messungen angewendet worden, um Inhibitoren für das Enzym tRNA-Guanin Transglykosylase (TGT) zu finden. Durch die gezielte Hemmung, der von TGT katalysierten Basenaustauschreaktion, könnten erste, spezifisch gegen den Erreger der bakteriellen Ruhr (Shigellosis) wirksame Antibiotika entwickelt werden. Jährlich kommt es zu ca. 160 Millionen Infektionen. Vor allen in Entwicklungsländern sterben auf Grund von Mangelernährung und schlechten hygienischen Bedingungen über eine Million der Infizierten. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit der katalytisch aktive Komplex von TGT und dem Substrat tRNA mit Hilfe von Mutationen, kinetischen Messungen und nanoESI-MS Experimenten untersucht. Die Kristallisation von TGT ist in vorangegangenen Arbeiten erfolgreich mit dem TGT Enzym von Z. mobilis durchgeführt worden, das nahezu identisch ist zu dem von S. flexneri. Verschiedene Grundgerüste wurden bereits in vorangegangenen Arbeiten entdeckt, darunter Pyridazinone, Pteridine und Quinazolinone, die alle eine Bindungsaffinität im mikromolaren Bereich aufweisen. Zusätzlich wurde das lin-Benzoguaningrundgerüst (3µM), das ein Guanin mit einem zusätzlichen Benzolring in seiner Mitte darstellt, gefunden und im Rahmen dieser Arbeit weiter verfolgt. Während des Optimierungsprozesses des lin-Benzoguanins sind zwei Aspekte in den Vordergrund getreten, die in vielen Designansätzen vernachlässigt werden: (i) wird deutlich, wie entscheidend die Veränderung von Protonierungszuständen durch Verschiebungen des pKa Wertes sein können, wenn der Ligand vom wässrigen Milieu in die Poteinbindetasche überführt wird und (ii) wird ein erfolgreiches Beispiel gezeigt, wie Wassermoleküle in den Wirkstoffdesignzyklus integriert werden können. Die Dekoration des lin-benzoguanine mit neuen Seitenketten liefereten Bindungsaffinitäten im nano molaren Bereich (2 nM). Zusätzlich wurde in dieser Arbeit der katalytisch aktive Komplex von TGT und dem Substrat tRNA mit Hilfe von Mutationen, kinetischen Messungen und nanoESI-MS Experimenten untersucht.Als Grundlage diente eine Kristallstruktur der TGT mit einem tRNA-Fragment. NanoESI-MS Untersuchungen konnte bestätigen, dass TGT als Homodimer vorliegt und ein tRNA Molekül bindet.