Non-Viral Delivery of Nucleic Acids and Image-Guided Assessment of in vivo Performance of Multifunctional Nanomedicines
In this thesis, new and multifunctional non-viral vectors for delivery of nucleic acids were synthesized and characterized concerning biophysicochemical parameters. Chapter 1 introduces into the field of nanomedicine which advanced drug delivery systems can be numbered among. Chapter 2 describes t...
Main Author: | |
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Contributors: | |
Format: | Doctoral Thesis |
Language: | English |
Published: |
Philipps-Universität Marburg
2009
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Subjects: | |
Online Access: | PDF Full Text |
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Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden neue und multifunktionelle nicht-virale Vektoren für den Transport von Nukleinsäuren synthetisiert und charakterisiert bezüglich ihrer biophysikochemischen Eigenschaften. Kapitel 1 leitet ein ins Feld sogenannter “Nanomedizin”, wozu hochentwickelte Arzneiformen gezählt werden können. Die Fragen, auf denen diese Arbeit beruhte, wie Spezifität nicht-viraler Vektoren, die Verwendung von Dendrimeren als Genvektoren, pharmakokinetische Fragestellungen in vivo applizierter siRNA, Stabilität von Polyelektrolytkomplexen unter in vivo Bedingungen, Eignung verschiedener Applikationsrouten, in vivo RNAi und Nanotoxikologie werden erläutert. Kapitel 2 beschreibt die Synthese 5 verschiedener 3-Integrin gerichteter Konjugate durch die Kopplung eines neuartigen kleinen Moleküls in zwei verschiedenen Kopplungsstrategien. Die Steigerung der Multimodalität dieser Konjugate durch Fluoreszenz- und Radioaktiv-Markierung erlaubten die weitere Charakterisierung ihrer Fähigkeit, pDNA in nanoskalige Komplexe zu kondensieren, die Charakterisierung ihrer Oberflächenladung, Bioverträglichkeit, Transfektionseffizienz und schließlich Spezifität. In Kapitel 3 wird eine neue Familie von Dendrimeren zum Gentransfer präsentiert. Die Synthese von 8 neuen Modifikationen in der Peripherie von starren Generation 2 Piperazin-verknüpften Triazin-Dendrimerem wird beschrieben, sowie der Peripherie-bedingte Einfluss auf biophysikochemische Eigenschaften und Transfektionseffizienz. Es wurde gezeigt, dass eine gewisse Menge primärer Amine oder Guanidinium-Gruppen als Endgruppen am wichtigsten für gute Transfektionseffizienz ist, während Alkylierung auch die Transfektionseffizienz erhöhte. Kapitel 4 ist die direkte Fortsetzung Kapitel 3. Entwicklungskriterien dieser zweidimensionalen Studie waren, den Einfluss der Generation und der Kernstruktur auf in vitro Eigenschaften zu untersuchen. Deshalb wurden die Generationen 1, 2 und 3 der starren Triazin-Dendrimere miteinander verglichen, aber auch flexiblere Kernstrukturen der Generation 2 synthetisiert und evaluiert. Bei vergleichsweise niedriger Toxizität erreichte das flexibelste Dendrimer der Generation 2 höhere Transfektionseffizienzen als PEI und SuperFect®. Kapitel 5 beschäftigt sich mit in vivo Transfer von siRNA. Es beschreibt ein schnelles und effizientes Verfahren zum Radiomarkieren und Aufreinigen von siRNA und zeigt Resultate von in vivo Anwendung und SPECT-Bildgebung. Invasiv und nicht-invasiv erhobene pharmakokinetische Parameter und Verteilungsdaten freier und PEI-komplexierter siRNA werden vergleichen, was bereits bekannte Akkumulation PEI-komplexierter siRNA in der Leber zeigte. In Kapitel 6 wurde die Methode, die im vorhergegangenen Kapitel optimiert wurde, verwendet, um siRNA für eine ausgiebige Vergleichsstudie zur in vivo Stabilität, Pharmakokinetik und Bioverteilung unterschiedlich PEGylierter PEI/siRNA Komplexe. Zusätzlich wurde Fluoreszenz-Fluktuations Spektroskopie angewendet, um die Stabilität unter in vivo Bedingungen zu quantifizieren. Aufgrund der eher dürftigen pharmakokinetischen Profile intravenös verabreichter (PEG-)PEI/siRNA-Polyplexe untersucht Kapitel 7 die Eignung der gleichen Komplexe für die intratracheale Anwendung. Dafür wurde in vitro Stabilität der Komplexe, in vivo Verweildauer in der Lunge, Biokompatibilität und Herunterregulierung in transgenen Mäusen getestet. PEG-PEI/siRNA-Komplexe schienen nach intratrachealer Applikation stabil zu sein und fortwährende Freisetzung von siRNA aufzuweisen, was signifikante Reduktion von EGFP-Expression in der Lunge fünf Tage nach Behandlung Actin-EGFP exprimierender Mäuse ermöglichte. Bioverträglichkeit wurde untersucht, und es wurde nur für 6 von 22 Chemo- und Zytokinen erhöhte Werte in der BALF gefunden. Kapitel 8 behandelt unerwünschte Effekte beim nicht-viralen Transfer von siRNA. Nachdem unerklärliche toxische Effekte in einer stabil Luciferase-exprimierenden Zelllinie beobachtet worden waren, wurden die Gründe dieser Effekte systematisch untersucht. Ein Matrix-Versuch zur Bestimmung der Hoch- und Runterregulierung von Genen ermöglichte anzunehmen, dass Aktivierung von CD30 bestimmte pro-apoptotische Signalwege in der p53-defizienten Zelllinie regulierte, die NFkB-Aktivierung einschlossen. In anderen Zelllinien verursachte NFkB zwar keinen Zelltod aber Aktivierung des CMV-Promotors, der die Luciferase-Expression reguliert. Nur die Etablierung einer Luciferase-exprimierenden Zelllinie, in der die Luciferase-Expression CMV-unabhängig ist, ermöglichte spezifische RNAi ohne größere Nebeneffekte.