Die Rolle von LIN-9 und B-MYB in der Zellzyklusregulation humaner Zellen

Das humane LIN-9 wurde zuerst als pRB-interagierendes Protein beschrieben und spielt eine Rolle als Tumorsuppressor im Kontext des pRB-Signalweges. Die Homologe von LIN-9 in D. melanogaster und in C. elegans, sind an der transkriptionellen Regulation verschiedener Genen beteiligt. B-MYB ist als dire...

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Main Author: Rein, Lena
Contributors: Gaubatz, Stefan (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2008
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Das humane LIN-9 wurde zuerst als pRB-interagierendes Protein beschrieben und spielt eine Rolle als Tumorsuppressor im Kontext des pRB-Signalweges. Die Homologe von LIN-9 in D. melanogaster und in C. elegans, sind an der transkriptionellen Regulation verschiedener Genen beteiligt. B-MYB ist als direktes E2F-Zielgen in D. melanogaster als Transkriptionsfaktor an der Genregulation differenzierungsspezifischer und zellzyklusregulierender Gene beteiligt und auch in Vertebraten (Zebrafisch) konnte ihm die Rolle eines haploinsuffizienten Tumorsuppressors zugewiesen werden. Der Verlust von B-MYB führte jeweils zu einem Anstieg von aneu- und polyploiden Zellen. Dies und die Tatsache, dass sowohl LIN-9 als auch B-MYB in der Genregulation von G2/M-Zielgenen eine Rolle spielen, ließ bedeutende Funktionen dieser Proteine in der Zellzyklusregulation vermuten. Primäres Ziel dieser Arbeit war daher die molekularbiologische Funktion von LIN-9 und B-MYB, besonders im Hinblick auf ihre Bedeutung während der Mitose, zu untersuchen. Dazu sollte mit Hilfe von FACS-Analysen, das Zellzyklusprofil LIN-9 oder B-MYB depletierter primärer humaner Neuroblastomzellen (SHEP-Zellen) im Vergleich zu Kontrollzellen untersucht werden. Hierfür wurden zunächst weitere shRNAs getestet, um die posttranskriptionelle Expression von LIN-9 in BJ-ET Zellen effizient zu reprimieren. In dieser Arbeit konnten zunächst Ergebnisse reproduziert werden, die zeigten, dass der Verlust von LIN-9 und B-MYB zu einer verminderten Expression einer Gruppe G2/M-spezifischer Gene führt, deren Produkte für die Funktion des Mitose-Checkpoints benötigt werden. Die verminderte Expression von G2/M-Genen in LIN-9 bzw. B-MYB depletierten Zellen geht mit einer Reihe phänotypischer Veränderungen einher, wie einen Defekt im mitotischen Spindel-Checkpoint, der dazu führt, dass die Zellen die Mitose auch nach Behandlung mit einem Spindelgift vorzeitig verlassen. Bei zusätzlichem Trigger kommt es in LIN-9 und B-MYB depletierten Zellen, bei weiterhin geringer ausgeprägtem G2/M-Block, zu einer deutlich erhöhten Apoptoserate, ohne signifikanten Anstieg von Aneu- oder Polyploidie. Eine Abhängigkeit von p53 oder p21 konnte nicht nachgewiesen werden. Bei Hinweisen auf eine deutlich verlangsamte Proliferation und einer Akkumulation der Zellen in der G2/M-Phase, ergaben die mit Hilfe eines Durchflusszytometers erstellten Zellzykluskinetiken, dass die Progression LIN-9 bzw. B-MYB depletierter Neuroblastomzellen von der S-Phase durch die G2/M-Phase und in die nächste G1-Phase deutlich verzögert ist. Es konnte weder ein Arrest dieser Zellen in der Mitose noch eine veränderte Länge der S-Phase nach LIN-9 oder B-MYB Depletion festgestellt werden. Daher ist die verlangsamte Zellzyklusprogression nach LIN-9 bzw. B-MYB Verlust höchstwahrscheinlich auf einen Defekt in der späten G2-Phase zurückzuführen, welcher in einem verzögerten Eintritt in die Mitose resultiert. In D. melanogaster und in C. elegans sind die Homologe von LIN-9 und B-MYB zusammen, als Bestandteile hoch konservierter RB/E2F-Komplexe, an der Regulation von Genen entscheidend beteiligt. Daher liegt es nahe, dass im humanen System LIN-9 und B-MYB ebenfalls Bestandteile eines ähnlichen Komplexes sind und dadurch in die Zellzyklusregulation eingreifen. Schlüsselwörter: LIN-9; B-MYB; Zellzyklus; G2/M-Übergang; Mitose
Physical Description:97 Pages
DOI:10.17192/z2009.0274