https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2009/0210/cover.png ths Prof. Dr. Gemsa Diethard Gemsa, Diethard (Prof. Dr.) , Müller, Susanna (Dr.) T-Lymphozyt doctoralThesis Allodepletion Medizin Philipps-Universität Marburg Depletion and suppression of human HLA-alloreactive T-cells by CD95L expressing cells monograph Knochenmarktransplantation Donor-lymphocyte-infusion (DLI) Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) Transplantationsimmunologie Jacobsen Eva-Maria Medical sciences Medicine Medizin https://doi.org/10.17192/z2009.0210 opus:2310 CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T-cells In dieser Arbeit wurde die Depletion alloreaktiver T-Zellen mittels CD95L exprimierender Zellen mit dem Ziel einer möglichen Anwendung von Donor-Lymphozyten-Präparaten nach allogener Stammzelltransplantation (SCT) untersucht. Die Infusion von Donor-Lymphozyten soll vor allem nach haploidenter SCT, bei der hochaufgereinigte Stammzellen verabreicht werden, die benötigte Zeit der Immunrekonstitution verkürzen. Dem Ansatz, CD95L exprimierende Zellen zur Allodepletion zu verwenden, lag die Tatsache zugrunde, dass vor allem aktivierte T-Zellen sensitiv für CD95L-vermittelte Apoptose wurden, während nicht aktivierte T-Zellen eher eine Resistenz gegenüber CD95L aufwiesen. Unter Anwendung gemischter Lymphozytenkulturen zur allogenen Stimulation wurde untersucht, ob CD95L exprimierende Zellen in diesen Kultursystemen effizient Apoptose induzieren können. Dafür erfolgte die Apoptoseinduktion durch lentiviral CD95L transduzierte B-Zell-Linien oder Fibroblasten entweder simultan zur – oder sequentiell nach – allogener Aktivierung der T-Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl allospezifische Proliferation als auch Zytotoxizität nach simultaner Aktivierung und Apoptoseinduktion durch die CD95L exprimierende B-Zell-Linie C1R-A1-CD95L vollständig inhibiert waren. Da diese Zell-Linie ausschließlich HLA-A1 spezifisch stimuliert – und Apoptose induziert, wurde hierdurch zwar die Effektivität der Apoptoseinduktion demonstriert, ohne jedoch klinisch praktikabel zu sein. Im nächsten Schritt wurde für eine potentielle klinische Anwendung ein sequentielles Kultursystem entwickelt, in dem eine EBV-transformierte B-Zell-Linie zur allogenen Stimulation verwendet und nachfolgend Apoptose durch CD95L-exprimierende Zellen induziert wurde. Auch in diesem System zeigten wir eine effektive Inhibition der Immunantwort: in vitro war keine residuale Alloreaktivität mehr nachweisbar. Der Vorteil des sequentiellen Kultursystems liegt in der universellen Einsetzbarkeit einer CD95L-exprimierenden Zell-Linie für die Depletion individueller, HLA-spezifisch stimulierter T-Zellen. Da CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen (Treg) für die Unterdrückung alloreaktiver Immunreaktionen und GvHD (Graft-versus-host-disease) nach SCT von großer Bedeutung sind, wurde außerdem deren Präsenz und Funktion nach erfolgter Apoptoseinduktion analysiert. Sowohl im simultanen als auch im sequentiellen Kultursystem blieben funktionelle CD4+CD25+FoxP3+ Treg erhalten. Treg, die hier durch eine mäßiggradige CD25 Expression charakterisiert waren, erwiesen sich als resistent gegenüber CD95L vermittelter Apoptose und wurden in den Kulturen mit C1R-A1-CD95L sogar angereichert. Interessanterweise ging die Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3, welcher für die Funktion von Treg essentiell ist, nicht konstant mit einer suppressorischen Wirkung einher. Erstmalig wurde Funktion und FoxP3-Expression nach Apoptoseinduktion untersucht und somit sichergestellt, dass es sich bei der residualen CD4+CD25+ Population tatsächlich um regulatorische T-Zellen handelte. Außerdem deuten unsere Ergebnisse auf eine antigenspezifische Funktion der erhaltenen Treg, was für eine klinische Anwendung von Bedeutung ist, da sonst das Risiko einer generellen Immunsuppression bestünde. Im Rahmen der Dissertation wurde eine Methode zur Depletion alloreaktiver T-Zellen mittels CD95L exprimierender B-Zell-Linien entwickelt, ohne dass regulatorische T-Zellen von der Apoptoseinduktion betroffen waren. Die Kombination aus selektiver Apoptoseinduktion allogen stimulierter T-Zellen und Suppression residualer Alloreaktivität durch Treg führte zu einer maximalen Effektivität des Systems und eröffnet vielversprechende Möglichkeiten für eine therapeutische Nutzung. Within the project as presented in this thesis, depletion of alloreactive human T-cells by CD95L-expressing cells was examined, aiming at transfer of donor-lymphocyte-infusions after allogenetic stem-cell-transplantation (SCT). Specifically after HLA-haploidentical SCT with highly purified stem cells, application of donor-lymphocytes could reduce the required time for immune-reconstitution of donor-derived T-cells. Using a mixed-lymphocyte-culture system for stimulation of HLA-alloreactive T-cells, the approach of CD95L expressing cells as stimulator cells for allodepletion was based on the fact that stimulated T-cells are highly sensitive towards CD95L-mediated apoptosis, while unstimulated T-cells are rather resistant. It was investigated, whether stimulation by CD95L-expressing cells could result in efficient apoptosis in simultaneous or sequential culture systems. To this extent, induction of apoptosis by lentivirally transducted CD95L-expressing B-cell-lines or fibroblasts was carried out either simultaneously to – or sequentially after – allogeneic activation of T-cells. It was demonstrated, that allospecific proliferation and cytotoxicity after simultaneous activation and induction of apoptosis were completely abolished by the CD95L-expressing B-cell-line C1R-A1-CD95L. Although we could demonstrate high effectivity of allodepletion, this system was not of clinical practicability because of solely HLA-A1 specific stimulation and apoptosis-induction by C1R-A1-CD95L. As a next step, a sequential culture system was developed for potential clinical use: an EBV-transformed B-cell-line was used for HLA-specific, allogeneic stimulation and apoptosis was induced in a second step by CD95L-expressing cells. In this system, we demonstrated effective inhibition of allogenetic immunoreactions after sequential activation and induction of apoptosis by CD95L: residual alloreactivitiy was abrogated. The advantage of this sequential culture system is the universal applicability of a CD95L-expressing cell-line for depletion of individually, HLA-specific allogeneic stimulated T-cells - thereby clinical applicability is given in principle. CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T-cells (Treg) have been proven of great importance for prevention and amelioration of alloreactive immune reactions and Graft-versus-host-Disease after SCT. Therefore, presence and function of Treg was examined after stimulation and induction of apoptosis by CD95L-expressing cells. In both culture systems, simultaneous and sequential, functional CD4+CD25+FoxP3+ Treg were preserved. Treg with intermediate CD25 expression were resistant towards CD95L mediated apoptosis and even enriched after culture with C1R-A1-CD95L. Interestingly, expression of the transcription factor FoxP3 did not necessarily correlate with suppressive function. Function of Treg and expression of FoxP3 was examined after induction of apoptosis for the first time. It was proven that indeed residual CD4+CD25+ cells were regulatory T-cells, and, furthermore, our results indicate antigen-specific function of residual Treg. This is of great importance for potential clinical use to prevent the risk of an otherwise general immune-suppressive function by Treg. In summary, the work presented in this thesis provides a method for effective depletion of alloreactive T-cells without affecting regulatory T-cells by using a CD95L-expressing B-cell-line. The combination of selective induction of apoptosis in stimulated, HLA-alloreactive T-cells and suppression of residual alloreactivity by Treg resulted in a highly efficient system and opens promising options for therapeutic applications. Periphere Stammzellentransplantation Hygiene u. Med. Mikrobiologie mit Medizinaluntersuchungsamt Fas-Ligand 2009 ppn:210706317 2009-01-15 2009-03-25 German CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen 2011-08-10 187 application/pdf urn:nbn:de:hebis:04-z2009-02106 Allodepletion Depletion und Suppression humaner HLA-alloreaktiver T-Zellen durch CD95L-exprimierende Zellen