Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von hybriden OmpF-Poren

Das gram-negative Bakterium Escherichia coli verfügt über eine äußere Membran, die als ein Schutzschild gegenüber der Zellumgebung dient. Hier ist das trimere Matrixporin OmpF lokalisiert, das eine β-Fass-artige Form einnimmt, und an seiner Engstelle durch die Schleife L3 auf einen Durchmesser von 7...

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Main Author: Reitz, Simon
Contributors: Essen, Lars-Oliver (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Das gram-negative Bakterium Escherichia coli verfügt über eine äußere Membran, die als ein Schutzschild gegenüber der Zellumgebung dient. Hier ist das trimere Matrixporin OmpF lokalisiert, das eine β-Fass-artige Form einnimmt, und an seiner Engstelle durch die Schleife L3 auf einen Durchmesser von 7 x 11 Å begrenzt wird. Dieses Protein wurde als Templat für die Erzeugung hybrider Ionenkanäle ausgewählt, die durch die Anwendung zwei verschiedener Strategien synthetisch modifiziert werden sollten. Die daraus resultierenden veränderten Eigenschaften wurden mittels Black Lipid Membrane-Messungen (BLM) an einzelnen Kanälen sowie durch strukturelle Untersuchungen bestimmt. Die erste Strategie bestand in der Teilung des Proteins in ein N-terminales Peptid, das festphasensynthetisch erzeugt wurde, sowie ein rekombinant überproduziertes C-terminales Polypeptid. Die Festphasensynthese erlaubte den Einbau einer nicht-natürlichen Aminosäure. Diese verfügte über eine funktionelle Alkin-Gruppe, an die durch Anwendung der [3+2]-Click-Chemie das fluoreszierende Dansylazid unter Bildung eines Triazolrings angeknüpft wurde. Im Anschluss daran wurden beide Fragmente in 8 M Harnstoff durch die Native Chemische Ligation (NCL) miteinander verknüpft. Die zweite Strategie sah die ortsspezifische Mutagenese ausgewählter Reste in ein Cystein vor, an die Iodacetamid-aktivierte Modulatoren angeknüpft werden konnten. So wurde an die Thiolgruppe neben der Dansylverbindung eine Dibenzo-18-Krone-6 angebracht. Die über beide Strategien generierten hybriden OmpF-Poren wurden durch schnelle Verdünnung in eine vesikelhaltige Suspension zurückgefaltet. Die Einzelkanalmessungen der Referenz-Proteine ergaben, dass deren Leitfähigkeiten keine signifikante Abweichung gegenüber dem membranextrahiertem Wildtyp-Protein mit einer Leitfähigkeit von 0.99±0.02 nS aufwiesen, und folglich geeignete Strategien zur Erzeugung naturähnlicher Ionenkanäle waren. Es stellte sich heraus, dass neben der Beschaffenheit des Modulators und der Lage in der Pore ebenfalls die Art der Anknüpfungsreaktion entscheidend für eine Leitfähigkeitsänderung war. So zeigten die über die zweite Strategie erzeugten hybriden OmpF-Kanäle eine deutliche Heterogenität in den erhaltenen Leitfähigkeitsniveaus mit einer gemittelten Reduktion der Leitfähigkeit von 16 19%, während das über [3+2]-Click-Chemie erhaltene Dansylhybrid keine signifikante Änderung zeigte. Der Dansyl-Modulator zeigte eine starke Ortsabhängigkeit, da die Anknüpfung an Cysteine, die nur ~5 Å voneinander entfernt lagen, einen drastischen Effekt bei den beobachteten Leitfähigkeitsniveaus ausmachte. Durch Kristallisation des OmpF-Kronenether-Hybrids konnte eine neue trigonale Kristallform beobachtet werden. Durch röntgenkristallographische Vermessung dieser Kristalle bis zu einer Auflösung von 3.2 Å wurde die Konformation des Modulators in der Pore aufgeklärt. Die gefundene inward-Orientierung wird durch elektrostatische Wechselwirkungen der Sauerstoff-Atome der Ethyleneinheiten mit polaren Aminosäuren des Poreninneren stabilisiert und ist daher verantwortlich für eine partielle Blockade der Pore.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0156