Studien zur Aufklärung des Funktionsmechanismus der Akrosomenreaktion in Spermien: Das Multi-PDZ-Domänen Protein MUPP1 als molekularer Organisator beteiligter Signaltranduktionsmoleküle

Die Akrosomenreaktion in Spermien ist eine spezielle Form der Calcium-regulierten Exocytose in somatischen Zellen. Ausgelöst durch die Bindung des Spermiums an die Zona pellucida der Eizelle verschmilzt das mit hydrolysierenden Enzymen gefüllte akrosomale Vesikel an mehreren Kontaktstellen mit der P...

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Main Author: Ackermann, Frauke
Contributors: Homberg, Uwe (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2008
Subjects:
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Description
Summary:Die Akrosomenreaktion in Spermien ist eine spezielle Form der Calcium-regulierten Exocytose in somatischen Zellen. Ausgelöst durch die Bindung des Spermiums an die Zona pellucida der Eizelle verschmilzt das mit hydrolysierenden Enzymen gefüllte akrosomale Vesikel an mehreren Kontaktstellen mit der Plasmamembran der männlichen Keimzelle, wodurch es zur Bildung einer Vielzahl von Pseudovesikeln und damit zur Freisetzung der akrosomalen Enzyme kommt. Bei diesem Prozess kann man zwei sequentielle und funktionell-gekoppelte Reaktionen unterscheiden: Durch den Kontakt des Spermiums mit der Zona pellucida wird zuerst ein kurzes Calcium-Signal ausgelöst, das die initialen Reaktionen der Vesikel-Anlagerung und Verankerung vermittelt. Anschließend wird durch das zeitlich-verzögerte aus dem Akrosom freigesetzte Calcium der finale Prozess der Fusionsporenbildung katalysiert. In jüngster Zeit hat sich gezeigt, dass die akrosomalen Sekretionsprozesse wie bei der Calcium-regulierten Exocytose in Neuronen durch die SNAREFusionsmaschinerie vermittelt werden. Jedoch sind die zugrunde liegenden molekularen Reaktionen und speziell die Mechanismen, die eine simultane Ausbildung einer Vielzahl von Fusionsporen entlang der Plasmamembran ermöglichen, gleichzeitig aber eine unbeabsichtigte Exocytosereaktion verhindern, noch weitgehend unverstanden. Im Rahmen meiner Doktorarbeit konnte ich zeigen, dass das Adapterprotein Multi-PDZ-Domänen Protein (MUPP1) in Spermien lediglich im Bereich des Akrosoms und dort entlang der akrosomalen Membran und der Plasmamembran lokalisiert ist. Damit scheint MUPP1 ein vielversprechender Kandidat,um mit Hilfe seiner 13 modular aufgebauten PDZ-Proteininteraktionsmotive eine Art Proteinnetzwerk unterhalb der Plasmammembran auszubilden. Mit diesem könnte durch Interaktion mit distinkten Signalmolekülen der sequentiell-verlaufenden akrosomalen Exocytose die simultane Bildung der zahlreichen Fusionsporen sichergestellt werden. Um diese Hypothese zu überprüfen, habe ich untersucht, ob MUPP1 an der Akrosomenreaktion funktionell beteiligt ist. Da Spermatozoen genetischen Methoden wie siRNA-Verfahren nicht zugänglich sind, habe ich kapazitierte und mit Streptolysin O permeabilisierte Spermien mit spezifischen Antikörpern gegen MUPP1 inkubiert. Die Resultate dieser Studien zeigen, dass die verwendeten Antikörper gegen das MUPP1-Protein in allen Fällen die Akrosomenreaktion signifikant inhibierten. Weiterführende funktionelle Stimulierungsexperimente, in denen das akrosomale Calcium mit einem UV-sensitiven Calcium-Chelator komplexiert wurde, haben darüber hinaus gezeigt, dass MUPP1 an den frühen Phasen der Erkennung der Zona pellucida und/oder der Vesikel-Anlagerung beteiligt ist, aber keine funktionelle Rolle beim Verschmelzungsprozess selbst übernimmt. Zur Identifizierung potentieller Interaktionspartner von MUPP1 in Spermien habe ich u. a. die Hefe-Zwei-Hybrid-Technik verwendet. Dabei konnte ich eine Vielzahl von möglichen Interaktionspartnern des MUPP1 aus cDNA des Hodens der Maus identifizieren, wobei ich das PDZ-Domänen Protein glutamate receptor interacting protein (GRIP1) zunächst für einen vielversprechenden Kandidaten gehalten habe, da es in Spermien einen supramolekularen Komplex mit der Phospholipase 4, einem Schlüsselenzym der akrosomalen Exocytose, bildet. Mit Hilfe verschiedener Fluoreszenz-technischer Nachweisverfahren konnte GRIP1 allerdings lediglich im Flagellum von Mausspermien nachgewiesen werden und kommt damit als physiologischer Bindungspartner für MUPP1 nicht in Betracht. Mit der Calcium/Calmodulin Kinase II (CaMKII) konnte ich jedoch einen MUPP1 Bindungspartner identifizieren, der nicht nur im Akrosom lokalisiert, sondern ähnlich wie MUPP1 auch, in Detergenz-unlöslichen Membranmikrodomänen, den lipid rafts,konzentriert ist. Funktionelle Stimulierungsexperimente zeigten darüber hinaus, dass eine spezifische Blockierung der CaMKII zu einer Potenzierung der spontanen Akrosomenreaktionsrate führte. Dies gibt einen Hinweis darauf, dass die Kinase in Form eines Clamps eine ungewollte Akrosomenreaktion unterbindet. Eine anschließende Behandlung der Spermien mit Calcium und Calmodulin löste die MUPP1-CaMKII Bindung und kann so offenbar zur Aufhebung des Fusions-Clamps führen.
DOI:10.17192/z2008.0754