Molekulare und evolutionäre Hintergründe der Kationenpermeation bei Mitgliedern der TRPM-Subfamilie
Wäring, Janine
Hypomagnesiämie mit sekundärer Hypocalciämie (HSH) ist ein Krankheitsbild, das sich durch Muskelkrämpfe und neurologische Schädigungen aufgrund des Magnesiummangels äußert. Verschiedene Punktmutationen im Gen des TRPM6-Proteins werden als Ursache für die Ausprägung von HSH angesehen. Mit dem TRPM6 ist der erste TRP-Kationenkanal identifiziert worden, der im Darm und in der Niere des Menschen für die Magnesiumaufnahme verantwortlich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wird eine neue, in einem HSH-Patienten gefundene Mutation in der putativen Porenregion des TRPM6 (P1017R) analysiert. Im Gegensatz zu den bisher untersuchten Mutanten, die nicht als funktionsfähiges Protein die Plasmamembran erreichen, konnte das TRPM6P1017R-Protein bei Koexpression mit TRPM7 in der Zellmembran lokalisiert werden. Die Analyse der TRPM6P1017R-Variante in Anwesen¬heit des zur Bildung von funktionalen Kanalkomplexen notwendigen TRPM7-Proteins zeigte, dass die entstehenden heteromeren Komplexe nicht in der Lage waren, detektierbare Ströme zu leiten. Weiterhin zeigte diese TRPM6-Mutante sowohl eine dominant-negative Wirkung auf die Funktion von heterolog exprimiertem TRPM7 als auch auf die in HEK293-Zellen endogen vorkommenden Kationenströme. Da der entsprechende Aminosäureaustausch im TRPM7-Protein die gleichen Auswirkungen in noch stärkerem Maße verursachte, kann dem Prolin an Position P1017 eine hohe Bedeutung in der Kanalpore von TRPM6- und TRPM7-Kanälen zugeordnet werden, da es für die Aufrechterhaltung ihrer physiologischen Funktion unentbehrlich zu sein scheint.
Weiterhin sollten durch zielgerichtete Mutagenesen in der Porenregion des divalent selektiven TRPM7- sowie des nichtselektiven TRPM2-Kanals Aufschlüsse über die molekularen Hintergründe der Permeationseigen¬schaften der TRPM-Subfamilie erlangt werden. Nach Substitution des Glutamats an Position 1047 durch ein Glutamin konnte die Divalentenpermeation des TRPM7-Kanals fast vollständig eliminiert werden. Gleichzeitig wurde durch diese Mutation die Inhibition der Kanalaktivität durch extrazelluläre, nicht aber die durch intrazel¬luläre Magnesium¬ionen beeinträchtigt. Zusammen mit einem weiteren Austausch eines Tyrosins zu Prolin (E1047Q/Y1049P) ergab sich eine Strom-Spannungs-Beziehung, die in hohem Maße der des TRPM2-Kanals ähnelt. Im Einklang mit diesen Beobachtungen zeigte die reziproke Doppelmutante im TRPM2-Protein im Vergleich zum Wildtyp eine stark erhöhte Permeation von divalenten Kationen. Somit konnten in dieser Arbeit zwei Positionen im Bereich der Pore der TRPM-Proteine identifiziert werden, die die Permeabilität dieser Kanalfamilie für divalente Kationen determinieren. Zusätzlich lassen phylogenetischen Analysen vermuten, dass diese beiden Aminosäuren und somit vermutlich auch die speziellen Permeationseigenschaften der Kanäle in einem evolutionären Prozess unterworfen waren. Dabei scheint der ursprüngliche TRPM-Kanal ein calciumpermeabler, TRPM2-ähnlicher Kanal mit einer NUDT9-ähnlichen Domäne und dem ’EVY’-Motiv gewesen zu sein. Das ’QIP’-Motiv taucht erst in später abgeleiteten Spezies auf. Der humane TRPM2 ist somit ein ’alter’ Kanal mit einer ’modernen’ Pore.
Zusammenfassend gibt diese Arbeit wertvolle Aufschlüsse über die Struktur-Funktions-Beziehung der Permeationseigenschaften von Kationenkanälen, die in einem phylogenetischen Kontext auch theoretische Rückschlüsse zur evolutionären Entwicklung der Porendomänen in TRP-Proteinen zulassen.
Philipps-Universität Marburg
Life sciences
https://doi.org/10.17192/z2008.0749
urn:nbn:de:hebis:04-z2008-07490
opus:2204
Hypocalcemia
https://doi.org/10.17192/z2008.0749
Hypocalciämie
2008-11-25
Calciumion
HSH
ths
Prof. Dr.
Homberg
Uwe
Homberg, Uwe (Prof. Dr.)
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Philipps-Universität Marburg
Wäring, Janine
Wäring
Janine
urn:nbn:de:hebis:04-z2008-07490
Calciumkonzentration
TRP
Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg
Universitätsbibliothek Marburg
Melastatin subfamily
Molecular and evolutionary determinants of cation permeation in members of the TRPM-subfamily
Biologie
Melastatin Subfamilie
monograph
Magnesiumion
doctoralThesis
Magnesium
2008
Hypomagnesiämie
140
application/pdf
https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2008/0749/cover.png
2008-10-21
Hypomagnesemia with secondary hypocalcemia (HSH) is characterized by generalized convulsions and neurological damage due to the lack of magnesium. Several point mutations in the TRPM6 gene have been found to be responsible for the development of the disease. Thus, TRPM6 is the first member of the TRPM channel subfamily to be involved in magnesium reabsorption in the human intestine and kidney. In the present study, a new mutation found in a patient with HSH (P1017R) was analyzed. In contrast to other mutations, which were not able to reach the cell surface, the TRPM6P1017R protein was localized in the cell membrane after coexpression with TRPM7. Measurements of TRPM6P1017R in the presence of TRPM7, which is necessary for the formation of functional channel complexes, revealed that the heteromeric channels containing the mutant protein were not capable of generating any currents. P1017R even supressed the current of the heterologously expressed TRPM7 protein, as well as endogenous cation currents in HEK293 cells, thus exhibiting a dominant negative effect. As the homologous mutation in TRPM7 (P1040R) decreased currents to an even higher degree, it can be concluded that this proline plays an important role in the pore of TRPM6 and TRPM7, and is essential for their physiological role.
Further studies focussed on the generation of pore mutants to gain insight into the molecular background determining divalent permeation properties in the TRPM subfamily. By performing site directed mutagenesis, single amino acids of the divalent selective TRPM7 channel were exchanged for the corresponding amino acids of the non selective TRPM2. The substitution of glutamate 1047 by glutamine almost abolished divalent permeation through the TRPM7 channel. At the same time, the inhibition of channel activity by extracellular, but not intracellular magnesium ions was profoundly affected. The additional substitution of a proline for a tyrosine (E1047Q/Y1049P) resulted in a current voltage relationship which strongly resembled that of TRPM2. In line with this observation, the reciprocal exchange of both amino acids in TRPM2 to those from TRPM7 resulted in a higher permeation of divalent cations. Hence, we identified two residues in the pore region that determine divalent cation permeability in the TRPM subfamily. In addition, a phylogenetic analysis revealed that these two amino acids and together with them the permeation properties of TRPM channels have changed during evolution. The ancestral TRPM channel was a calcium-permeable, TRPM2-like protein with a NUDT9-like domain and the ’EVY’-motif. The ’QIP’-motif only appeared in more recent species. Therefore, human TRPM2 is an ancient channel with a ’modern’ pore.
In conclusion, the present study offers valuable clues to the relationship between structure and permeation properties in cation channels. In a phylogenetic context, these results allow conclusions about the evolution of the pore region in TRPM proteins.
Hypomagnesiämie mit sekundärer Hypocalciämie (HSH) ist ein Krankheitsbild, das sich durch Muskelkrämpfe und neurologische Schädigungen aufgrund des Magnesiummangels äußert. Verschiedene Punktmutationen im Gen des TRPM6-Proteins werden als Ursache für die Ausprägung von HSH angesehen. Mit dem TRPM6 ist der erste TRP-Kationenkanal identifiziert worden, der im Darm und in der Niere des Menschen für die Magnesiumaufnahme verantwortlich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wird eine neue, in einem HSH-Patienten gefundene Mutation in der putativen Porenregion des TRPM6 (P1017R) analysiert. Im Gegensatz zu den bisher untersuchten Mutanten, die nicht als funktionsfähiges Protein die Plasmamembran erreichen, konnte das TRPM6P1017R-Protein bei Koexpression mit TRPM7 in der Zellmembran lokalisiert werden. Die Analyse der TRPM6P1017R-Variante in Anwesen¬heit des zur Bildung von funktionalen Kanalkomplexen notwendigen TRPM7-Proteins zeigte, dass die entstehenden heteromeren Komplexe nicht in der Lage waren, detektierbare Ströme zu leiten. Weiterhin zeigte diese TRPM6-Mutante sowohl eine dominant-negative Wirkung auf die Funktion von heterolog exprimiertem TRPM7 als auch auf die in HEK293-Zellen endogen vorkommenden Kationenströme. Da der entsprechende Aminosäureaustausch im TRPM7-Protein die gleichen Auswirkungen in noch stärkerem Maße verursachte, kann dem Prolin an Position P1017 eine hohe Bedeutung in der Kanalpore von TRPM6- und TRPM7-Kanälen zugeordnet werden, da es für die Aufrechterhaltung ihrer physiologischen Funktion unentbehrlich zu sein scheint.
Weiterhin sollten durch zielgerichtete Mutagenesen in der Porenregion des divalent selektiven TRPM7- sowie des nichtselektiven TRPM2-Kanals Aufschlüsse über die molekularen Hintergründe der Permeationseigen¬schaften der TRPM-Subfamilie erlangt werden. Nach Substitution des Glutamats an Position 1047 durch ein Glutamin konnte die Divalentenpermeation des TRPM7-Kanals fast vollständig eliminiert werden. Gleichzeitig wurde durch diese Mutation die Inhibition der Kanalaktivität durch extrazelluläre, nicht aber die durch intrazel¬luläre Magnesium¬ionen beeinträchtigt. Zusammen mit einem weiteren Austausch eines Tyrosins zu Prolin (E1047Q/Y1049P) ergab sich eine Strom-Spannungs-Beziehung, die in hohem Maße der des TRPM2-Kanals ähnelt. Im Einklang mit diesen Beobachtungen zeigte die reziproke Doppelmutante im TRPM2-Protein im Vergleich zum Wildtyp eine stark erhöhte Permeation von divalenten Kationen. Somit konnten in dieser Arbeit zwei Positionen im Bereich der Pore der TRPM-Proteine identifiziert werden, die die Permeabilität dieser Kanalfamilie für divalente Kationen determinieren. Zusätzlich lassen phylogenetischen Analysen vermuten, dass diese beiden Aminosäuren und somit vermutlich auch die speziellen Permeationseigenschaften der Kanäle in einem evolutionären Prozess unterworfen waren. Dabei scheint der ursprüngliche TRPM-Kanal ein calciumpermeabler, TRPM2-ähnlicher Kanal mit einer NUDT9-ähnlichen Domäne und dem ’EVY’-Motiv gewesen zu sein. Das ’QIP’-Motiv taucht erst in später abgeleiteten Spezies auf. Der humane TRPM2 ist somit ein ’alter’ Kanal mit einer ’modernen’ Pore.
Zusammenfassend gibt diese Arbeit wertvolle Aufschlüsse über die Struktur-Funktions-Beziehung der Permeationseigenschaften von Kationenkanälen, die in einem phylogenetischen Kontext auch theoretische Rückschlüsse zur evolutionären Entwicklung der Porendomänen in TRP-Proteinen zulassen.
Molekulare und evolutionäre Hintergründe der Kationenpermeation bei Mitgliedern der TRPM-Subfamilie
German
Transient receptor potential
opus:2204
2011-08-10
Fachbereich Biologie
Hypomagnesemia
PRESERVATION_MASTER
VIEW
Image
PRESERVATION_MASTER