Molekulare und biochemische Aspekte der Furanocumarinbiosynthese in Ammi majus L.

Die molekulare Aufklärung der linearen Furanocumarinbiosynthese bietet die Möglichkeit innovativer humantherapeutischer Anwendungen sowie die Datengrundlage für die Aufklärung der angulären Furanocumarinbiosynthese und evolutionärer Pflanzen-Insekt-Interaktionen. Der Furanocumarinbiosyntheseweg füh...

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Main Author: Kellner, Sandra
Contributors: Matern, Ulrich (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2008
Subjects:
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Description
Summary:Die molekulare Aufklärung der linearen Furanocumarinbiosynthese bietet die Möglichkeit innovativer humantherapeutischer Anwendungen sowie die Datengrundlage für die Aufklärung der angulären Furanocumarinbiosynthese und evolutionärer Pflanzen-Insekt-Interaktionen. Der Furanocumarinbiosyntheseweg führt von Umbelliferon über C-Prenylierung zu Demethylsuberosin (lineare Furanocumarine) bzw. Osthenol (anguläre Furanocumarine) und die nachfolgende oxidative Zyklisierung zu (+)-Marmesin bzw. (+)-Columbianetin, welche durch oxidative Spaltung zu Psoralen bzw. Angelicin umgesetzt werden. Jeder dieser Reaktionsschritte, ebenso wie die Hydroxylierung von Psoralen zu Bergaptol und dessen O-Methylierung zu Bergapten, wurde in früheren Untersuchungen in vitro nachgewiesen. Die Membran-Bindung in Kombination mit der Sauerstoff- und NADP(H)-Abhängigkeit der beteiligten Enzyme, mit Ausnahme der Prenyltransferase und der Bergaptol O-Methyltransferase, lassen auf Cyt P450s schließen. Molekular charakterisiert waren zu Beginn dieser Arbeit aus Ammi majus nur die Zimtsäure 4-Hydroxylase (C4H, Hübner et al., 2003) sowie die Bergaptol O-Methyltransferase (BOMT, Hehmann et al., 2004). C4H katalysiert eine „frühe“ Reaktion noch vor dem spezifischen Weg zu Cumarinen und ist an mehreren Stoffwechselwegen beteiligt, das lösliche BOMT ist ein Furanocumarin-spezifisches Enzym im „späten“ Verlauf der Furanocumarinbiosynthese. Die molekulare Charakterisierung eines Furanocumarin-spezifischen Cyt P450 war bislang noch nicht bekannt. Da eine traditionelle Reinigung der Enzyme nicht möglich erschien, bestand das vorrangige Ziel der Arbeit darin, Furanocumarin-spezifische Cyt P450s durch cDNA-Amplifikation und funktionelle Expression zu identifizieren. Ammi majus eignet sich, neben dem Interesse an seiner Bedeutung als Arzneipflanze, besonders für dieses Vorhaben, weil in dunkel kultivierten Zellsuspensionskulturen keine Furanocumarine und spezifische Enzymaktivitäten vorhanden sind. Nach Pmg-Elicitierung der Zellkultur kommt es jedoch zu einer raschen Furanocumarin-Akkumulation, wobei innerhalb dieses Zeitfensters vermutlich die spezifischen Transkripte transient induziert werden. Auf dieser Grundlage erschien für die Isolierung Furanocumarin-spezifischer Cyt P450-Transkripte eine differentielle Klonierungs-Strategie unter Einbezug neuer Technologien Erfolg versprechend. Eine funktionelle Identifizierung eines oder mehrerer dieser Transkripte als Furanocumarin-spezifisches Enzym sollte die exakte Messung der Induktion unter verschiedenen Stressoren und molekulare Vergleiche bzw. phylogenetische Studien ermöglichen und dadurch die Identifizierung weiterer Enzyme dieses Stoffwechselweges erleichtern. Ein weiteres Ziel war die gewebespezifische Lokalisation des Furanocumarin-Stoffwechsels von der juvenilen bis zur adulten Pflanze. Die diesbezüglichen Aussagen in der Literatur sind teils widersprüchlich und konzentrieren sich meist nur auf Wurzel und Früchte. Der Nachweis Furanocumarin-spezifischer Transkripte in den verschiedenen Organen über die Entwicklung der Pflanzen kann erstmalig ein präziseres Bild liefern und im Zusammenhang mit der Produkt-Akkumulation Fragen zum Transport von Cumarinen und zur Altersabhängigkeit der Biosynthese klären. Die differentielle Klonierung aus elicitierten Ammi majus Zellen hatte bereits einige, funktionell nicht charakterisierte Cyt P450-Klone, unter anderem CYP71AJ1, geliefert (Specker, 2003). Im Verlauf dieser Arbeit konnte CYP71AJ1 als Psoralensynthase (POS) identifiziert (Larbat et al., 2007) und molekular charakterisiert werden. Die POS ist somit das erste genetisch und biochemisch charakterisierte Cyt P450 aus der Furanocumarinbiosynthese. Unter mehreren Elicitoren war die stärkste Induktion der Furanocumarinbiosynthese in Zellsuspensionskulturen mit Pmg zu beobachten. Das Zeitfenster der Furanocumarin-Bildung lag in den ersten 10 Stunden, danach wurden verstärkt weitere Stoffwechselwege induziert, wie das Transkriptmuster der C4H vermuten lässt. In der Pflanze konnte die Induktion spezifischer Transkripte v.a. in den Wurzeln und Blüten lokalisiert werden, während die Furanocumarine tendenziell in den Blättern, sowie im späteren Entwicklungsverlauf in den generativen Organen akkumulierten. Die zusätzliche Transkript-Akkumulation in den Blüten verdeutlicht die Bedeutung der Furanocumarine als Phytoalexine und als allelopathische Keimungsinhibitoren für den Fortbestand der Pflanze. Das zeitliche Muster, die Abhängigkeit von unterschiedlichen Elicitoren und die Gewebespezifität können hilfreich sein bei der Suche nach weiteren Cumarin-spezifischen Cyt P450s. Drei neue Cyt P450-Transkripte und gDNAs (CYP71AZ1, CYP71D97, CYP71D98) wurden isoliert und charakterisiert, unter denen die Substraterkennungsregionen und das Induktionsmuster von CYP71AZ1 eine Beteiligung an der Furanocumarinbiosynthese vermuten lassen. Allerdings konnte die funktionelle Expression bisher nicht erreicht werden.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2008.0499