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Strukturelle und funktionelle Untersuchungen an Substratbindeproteinen aus ABC-Transportern zur Aufnahme von kompatiblen Solute
Kompatible Solute wie Glycinbetain, Prolinbetain, Dimethylsulfonioacetat, Dimethylsulfoniopropionat, Homobetain, Cholin, Glucosylglycerol, Saccharose oder Trehalose schützen bakterielle Zellen vor osmotischem Stress, durch Aufrechterhaltung des Turgors, weil sie osmotisch aktiv sind ohne den Zell...
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| Main Author: | |
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2008
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Kompatible Solute wie Glycinbetain, Prolinbetain, Dimethylsulfonioacetat,
Dimethylsulfoniopropionat, Homobetain, Cholin, Glucosylglycerol, Saccharose oder
Trehalose schützen bakterielle Zellen vor osmotischem Stress, durch Aufrechterhaltung des
Turgors, weil sie osmotisch aktiv sind ohne den Zellmetabolismus zu stören. Zusätzlich dazu
protektieren kompatible Solute die Zellen noch auf zwei anderen Wegen: (i) in dem sie als
Proteinstabilisierer fungieren, da sie von der Oberfläche von Proteinen ausgeschlossen sind
und (ii) indem sie die Membranen osmotisch gestresster Zellen stabilisieren. Aus diesem
Grund werden die kompatiblen Solute bis hin zu molaren Konzentrationen per de novo
Synthese oder durch den Import dieser Stoffe aus der Umwelt akkumuliert. Die Aufnahme
geschieht u. a. über hochaffine Transportsysteme des ATP-binding cassette (ABC) Typs.
ABC-Transporter bestehen aus einem membrandurchspannenden Teil, der zwei Permeasen
und zwei cytoplasmatisch vorliegende, assoziierte ATPasen enthält, sowie einem
extrazellulären oder periplasmatischen Teil, dem Substratbindeprotein. Dieses Protein bindet
die kompatiblen Solute mit hoher Affinität, beliefert den membrandurchspannenden
Translokationskomplex mit dem Substrat und ermöglicht so die Aufnahme der Substrate in
die Zelle. Substratbindeproteine von ABC-Transportern bestehen aus zwei globulären
Domänen, die durch zwei Peptidlinker miteinander verbunden sind. Zwischen diesen
Domänen entsteht ein tiefer Spalt, der die Substratbindetasche bildet. Die Bindung des
Substrates induziert eine Konformationsänderung im Bindeprotein. Die Domänen bewegen
sich wie eine greifende Hand aufeinander zu. Das Bindeprotein schließt sich und hält das
gebundene Substrat tief im Inneren dieser Proteinspalte fest. Damit steht das kompatible
Solute in direktem Kontakt mit dem Protein. Die interessante Frage dabei ist: Wie ist dies
möglich? Kompatible Solute werden von Proteinoberflächen ausgeschlossen, ihre
Makromolekül stabilisierenden Eigenschaften sind auf diese Tatsache zurück zu führen.
Frühere Studien konnten bereits zeigen, dass für die kompatiblen Solute Glycinbetain,
Prolinbetain, Ectoin und Hydroxyectoin Kation π-Interaktionen essentielle Determinanten in
der Substratbindung darstellen. Kation π-Interaktionen sind ungewöhnlich starke
Interaktionen zwischen den delokalisierten, negativ geladenen π-Elektronen eines
aromatischen Systems und einem Kation bzw. einer positiven Partialladung in einem größeren
Molekül. Diese Interaktionen sind stark genung um solche geladenen Komponenten, wie es
auch die kompatiblen Solute sind, aus ihrer Hydrathülle, in der sie in aquatische Umgebung
vorliegen, heraus zu ziehen und so ihre Bindung im Inneren eines Proteins zu ermöglichen.
Dies wirft allerdings neue Fragen auf, deren Beantwortung Thema der vorliegenden
Dissertation war: (i) wie können diese Proteine Substrate mit ähnlicher Ladungsverteilung
unterscheiden oder anders gefragt, wie wird die Spezifität dieser Substratbindeproteine
determiniert? (ii) wie werden ungeladene kompatible Solute wie die verschiedenen Zucker
gebunden? Welche Interaktionen determinieren in diesem Fall die Spezifität und Affinität der
Bindeproteine? Zur Beantwortung dieser Fragen wurden in der vorliegenden Arbeit drei
Bindeproteine für kompatible Solute heterolog produziert, gereinigt und charakterisiert:
OpuAC aus Bacillus subtilis, ChoX aus Sinorhizobium meliloti und GgtB aus Synchocystis sp.
PCC6803. Anhand der Kristallstrukturen des OpuAC-Proteins im Komplex mit seinen
Substraten Glycinbetain, Prolinbetain und DMSA in Kombination mit einer umfangreichen
Mutagenesestudie konnten wichtige Erkenntnisse zur Ausbildung der Spezifität von
Substratbindeproteinen für kompatible Solute gewonnen werden. Vergleiche von OpuAChomologen
Proteinen aus Proteindatenbanken und der in dieser Arbeit untersuchten Proteine
untereinander, brachten weitere Ergebnisse darüber, wie Spezifität über die Kombination
zwischen aromatischen Interaktionen und Wasserstoffbrücken zur Substratbindung, durch
Bindeproteine erreicht werden kann. |
|---|---|
| Physical Description: | 195 Pages |
| DOI: | 10.17192/z2008.0486 |