GLI genes: Cis-Acting Regulatory Elements

Frühembryonale Musterbildung wird durch zahlreiche komplexe Signalwege gesteuert. Funktionelle Interaktionen zwischen Komponenten einer bestimmten Signalübertragungs-Kaskade erfolgen auf vielen Ebenen, darunter bei der Bindung extrazellulärer Signalmoleküle an ihre Rezeptoren, beim Import der Signale von den Rezeptoren zum Zellkern oder bei der Interpretation eines Signals durch Aktivierung oder Repression der Expression von Zielgenen mittels Transkriptionsfaktoren. Präzise funktionelle Querverbindungen zwischen den Schritten einer Kaskade sind essentiell für eine normale Entwicklung. Die Mitglieder der GLI-Genfamilie sind wichtige Vermittler der Signalinformation im “SONIC HEDGEHOG (SHH)-Signalweg“. Während der letzten Jahrzehnte wurden die Mitglieder der GLI-Familie von Transkriptionsfaktoren eingehend mit genetischen, molekularen und biochemischen Methoden erforscht. Dadurch verfügen wir jetzt über reiche Informationen zur intrazellulären Lokalisierung der GLI-Proteine, über ihre Interaktionspartner, ihre Antwort auf SHH-Signale, über die Art ihres Transports in den Zellkern und auch über einige ihrer Zielproteine. Zudem wurde reiches Wissen über Entwicklungsstörungen beim Menschen und anderen Modellorganismen, die mit Mutationen von Mitgliedern der GLI-Genfamilie einhergehen, zusammengetragen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung der GLI-Proteine für die Säugerentwicklung und die Evolution der Wirbeltiere untersucht, indem folgende Fragen beantwortet wurden: I) Wie wird die Expression von GLI-Genen während der frühen embryonalen Entwicklung in Wirbeltierembryonen reguliert? II) Nach welchen Mustern entwickelten sich die GLI-Proteine innerhalb einer Art und zwischen den Arten der Wirbeltiere. III) Welche evolutionären Mechanismen haben dazu geführt, dass die paralogen GLI-Gene mit anderen Mitgliedern der HOX-Cluster-Paraloga in drei oder vier syntänen Abschnitten auf vier Chromosomen zusammen auftreten (beim Menschen auf den Chromosomen Hsa2, 7, 12 und 17)? Um genetische Mechanismen aufzuklären, mittels derer die Transkription von GLI-Genen während der frühen Embryonalentwicklung gesteuert wird, wurde in dieser Arbeit ein Familienmitglied, das menschliche GLI3-Gen, ausgewählt. Durch evolutionären Sequenzvergleich zwischen zahlreichen Arten wurde in den Introns von GLI3 eine Architektur zwischen Tetrapoden und Teleostiern hochkonservierter, nicht kodierender Abschnitte entdeckt. Um darunter nach möglichen Enhancern der Genexpression zu fahnden, wurden 11 dieser konservierten nicht-kodierenden Elemente (CNEs) für eine funktionelle Analyse ausgewählt. Bei dieser wurde gezeigt, dass die hochkonservierten nichtkodierenden Sequenzabschnitte in menschlichen Zelllinien und in der Embryogenese von Modellorganismen, Zebrafisch, Gliedmaßenentwicklung beim Hühnchen und in der Maus GLI3-spezifische regulatorische Aufgaben erfüllen konnten. Unter anderem hat diese Untersuchung zwei Enhancer definiert, die offenbar imstande sind, alle Aspekte der endogenen GLI3-Expression in knorpelbildenden und nicht-knorpelbildenden Mesenchymen embryonaler Gliedmaßen in einer nicht-redundanten Weise zu rekapitulieren. In vivo-Daten von Zebrafisch, Hühnchen und Maus deuten darauf hin, dass ein über lange Zeiträume hin konservierter Enhancer im Verlauf der Evolution dafür umfunktioniert wurde, die GLI3-Expression in “moderneren” Abschnitten der Gliedmaßenstruktur, wie in Händen und Füßen (Autopodia), zu steuern. Demgegenüber behielt eine zweite Gliedmaßen-spezifische Enhancerregion ihre ursprünglichen Funktionen bei, die Expression von GLI3 in “alten” Bereichen von Flossen/Gliedmaßen, dem Stylopod und dem Zeugopod festzulegen. Um für kodierende Bereiche der GLI-Gene Muster der evolutionären Entwicklung aufzuschlüsseln, wurde eine molekulare Analyse in silico durchgeführt, in die GLI-Sequenzen representativer Mitglieder der Tetrapoden- und Teleostier-Entwicklungslinien einbezogen wurden. Diese Untersuchung bestätigte, dass die Veränderungen, denen die GLI-Sequenzen im Verlauf der Evolution unterlagen, grundsätzlich mit den bekannten funktionellen Ähnlichkeiten und Unterschieden innerhalb und zwischen den Arten zusammenpassen. Weiterhin wurde in der vorliegenden Arbeit der Versuch unternommen, die Vorgänge im Verlauf der Evolution zu beleuchten, die die menschlichen paralogen GLI-Gene und Mitglieder mehrerer anderer Genfamilien in der Nähe der HOX-Cluster auf vier Chromosomen jeweils in drei oder vier kollinearen Abschnitten zusammengeführt haben (beim Menschen auf den Chromosomen 2, 7, 12 und 17). Dazu wurde die phylogenetische Geschichte von 11 Multigenfamilien analysiert, von denen drei oder mehr Mitglieder mit den menschlichen HOX-Clustern gekoppelt sind. Die Ergebnisse dieser Untersuchung deuten darauf hin, dass die heute beobachtete umfangreiche Syntänie auf drei oder vier menschlichen HOX-Cluster-tragenden Chromosomen das Ergebnis früherer kleiner Duplikationen (von Segmenten oder Gengruppen) widerspiegelt, auf die zu unterschiedlichen Zeiten während der Chordatenevolution genomische Rearrangements folgten.