Structural and mutational characterisation of Shigella Pathogenicity Factors

An der Bakterienruhr, verursacht durch Shigellen, erkranken jährlich 163 Mio. Menschen. Die Erreger dringen in die Colon-Epithelzellen des Wirtes ein, vermehren sich dort und infizieren weitere Epithelzellen. Durch diesen Prozess wird ein Großteil des Epithels zerstört. Die Fähigkeit der Shigellen zur Invasion ist auf einem Virulenzplasmid kodiert. Die Expression der sog. Invasin-Gene wird durch den Virulenzfaktor VirF kontrolliert. Die Translation der virF-mRNA ist von der Aktivität eines tRNA-modifizierenden Enzyms, der tRNA-Guanin-Transglycosylase (TGT), abhängig. TGT- Defektmutanten von Shigellen sind kaum noch in der Lage, Wirtszellen zu penetrieren. Im ersten Teil der Arbeit wurden die Invasingene ipaA, spa15, ipgB2, ospD1, ipgE, die für den Shigella-Invasionsmechanismus an unterschiedlicher Stelle von Bedeutung sind, kloniert und durch E. coli in großen Mengen produziert, lagen jedoch im Falle von IpaA, OspD1, IpgB2 unlöslich in Form von Einschlusskörpern vor. IpgE wurde als Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein erfolgreich in löslicher Form in E. coli überproduziert und mittels Affinitäts-, sowie Größenausschlusschromatographie gereinigt. Die Identität des Proteins wurde mittels Massenspektrometrie verifiziert. Durch ein Kristallisationsscreening wurden Bedingungen identifiziert, die zur IpgE- Kristallisation geeignet sind. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Mutagenesestudien an einem Target der Wirkstoffentwicklung gegen Shigella - der TGT - durchgeführt, um neue Erkenntnisse über Substrat-Spezifität und -Selektivität gewinnen zu können. Die TGTs, evolutionär alte Enzyme, sind in allen drei Domänen des Lebens vertreten, unterscheiden sich allerdings in ihrer Substrat-Spezifität und -Selektivität. So katalysieren zwar alle drei Varianten eine Austauschreaktion, bei der eine Guaninbase in tRNAs durch eine modifizierte Base ersetzt wird. Die eingefügte modifizierte Base ist jedoch in den drei Domänen verschieden (Archae: preQ0; Bakterien: preQ1; Eukaryoten: Queuin). Interessanterweise können eukaryotische TGTs in vitro auch die beiden Substrate ihrer verwandten TGTs erkennen und in tRNAs inserieren, während ihre archaeaelle Variante außer dem eigenen Substrat nur Guanin in der Bindetasche aufnehmen kann. Die bakterielle TGT erkennt zwar ebenfalls das archaeaelle Substrat, kann aber das eukaryotische Substrat nicht umsetzen. Die unterschiedlichen Substratspezifitäten der archaeaellen und bakteriellen TGTs beruhen auf einem Peptidbindungsflip im aktiven Zentrum, der in Bakterien durch den Protonierungszustand von Glu235 kontrolliert wird. Der Peptidflip ändert die Eigenschaften der Bindetasche so, dass entweder Guanin oder preQ1 gebunden werden kann. Das Konformer, das Guanin erkennt, ist ebenfalls in der Lage, preQ0 zu binden. In Archaea kann die entsprechende Peptidbindung ihre Orientierung nicht ändern, da sie durch eine invariante Rückgratwechselwirkung stabilisiert wird. Für eine TGT(E235Q)-Variante, die, ähnlich dem archaeaellen Enzym, eine bevorzugte Stabilisierung des Peptipflips in derjenigen Orientierung gewährleisten sollte, die das Binden von Guanin und preQ0 bevorzugt, konnte gezeigt werden, dass die Selektivität zugunsten von preQ0 umgekehrt wird. Kristallstrukturen der mutierten TGT in Komplex mit den verschiedenen Substraten konnten belegen, dass die Bindetasche im mutierten Enzym tatsächlich hauptsächlich in der Konformation vorliegt, die das Binden von Guanin und preQ0 ermöglicht. Die Substrat-Promiskuität der eukaryotischen TGT basiert darauf, dass die Substratbindetasche sehr groß sein muss, um Queuin aufnehmen zu können. Die entscheidenden Interaktionen werden jedoch zu dem guaninähnlichen Teil des Moleküls ausgebildet, der in allen drei Substraten analog ist. So können auch die wesentlich kleineren, aber in diesem Bereich sehr ähnlichen Substrate preQ0 und preQ1 durch die eukaryotische TGT erkannt und umgesetzt werden. Im Vergleich eines Homologiemodells der humanen TGT mit einer Kristallstruktur der Zymomonas mobilis TGT (ZmTGT) wurden Aminosäuren identifiziert, die für eine Vergrößerung der Bindetasche in eukaryotischen TGTs verantwortlich sein könnten. Um die Unterschiede der bakteriellen und humanen TGT-Bindetaschen näher zu beleuchten, wurden ZmTGT- Varianten konstruiert, bei denen diese Reste ausgetauscht wurden, um eine solch vergrößerte Bindetasche zu schaffen, und biochemisch sowie strukturell charakterisiert. Die erzeugten TGT-Varianten zeigten eine signifikante Erniedrigung ihrer Wechselzahlen. In kinetischen Messungen wurde beobachtet, dass TGT(V233G), sowie unerwarteter Weise bereits Wildtyp-TGT bei sehr hohen Queuin-Konzentrationen in der Lage sind, radioaktiv markiertes Guanin aus tRNA in Gegenwart von Queuin auszubauen. Analyse von Komplex- Kristallstrukturen und Molekular-Dynamik-Simulationen unterstützen diese Ergebnisse.