Amide Bond Formation in Nonribosomal Peptide Synthesis:The Formylation and Condensation Domains

Nonribosomal peptides are of outstanding pharmacological interest, since many representatives of this highly diverse class of natural products exhibit therapeutically important activities, such as antibacterial, antitumor and immunosuppressive properties. Understanding their biosynthesis performed b...

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Main Author: Schönafinger, Georg
Contributors: Marahiel, Mohamed (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2007
Subjects:
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Table of Contents: Nichtribosomale Peptide gelten als pharmakologisch hochinteressante Stoffklasse, da zahlreiche ihrer vielfältigen Vertreter wichtige Bioaktivitäten, wie beispielsweise antibiotische, antitumorale oder immunosuppressive Eigenschaften aufweisen. Das Verständnis ihrer Biosynthesen, welche von multimodularen Mega-Enzymen, den nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS), bewirkt werden, stellt eine Schlüsselvoraussetzung dafür dar, diese Synthesemaschinerien zur Produktion neuer Therapeutika nutzen zu können. Das zentrale Strukturmotiv aller Peptide ist die Peptid- (oder Amid-) Bindung. In der vorliegenden Arbeit wurden daher zwei verschiedene katalytische Einheiten aus NRPS untersucht, welche die Ausbildung von Amidbindungen katalysieren: Die Kondensations- (C-) und die Formylierungs- (F-) Domäne. Zum einen wurde die N-terminale F-Domäne aus LgrA1 biochemisch charakterisiert. Sie ist Bestandteil des NRPS-Systems, das für die Biosynthese des linearen Gramicidins notwendig ist. Durch in-vitro-Experimente mit dem rekombinanten Enzym F-A-PCPLgrA1, konnte dessen Akzeptor-Substratspezifität für die PCP-gebundenen verzweigt-aliphatischen Aminosäuren Valin, Isoleucin und Leucin aufgedeckt werden. Aufgrund von Sequenzvergleichen mit anderen Formyltransferasen wurde erwartet, dass auch in diesem Falle N10-Formyltetrahydrofolat (N10-fTHF) als Formylgruppendonor dient. Dieses wurde auf chemoenzymatischem Wege hergestellt und erfolgreich in den Formylierungsassays eingesetzt. Interessanterweise, konnte auch dessen Isomer, das N5-fTHF, eingesetzt werden – obgleich hierbei eine um den Faktor 18 langsamere Produktbildung beobachtet wurde. Anschließend wurde die Notwendigkeit eines formylierten Startbausteins für die Initiation der nichtribosomalen Biosynthese mit Hilfe des dimodularen Konstrukts F-A-PCP-C-A-PCPLgrA1-2 in vitro untersucht. Es stellte sich heraus, dass in Abwesenheit des Formyldonors kein Dipeptid erzeugt wird, wohingegen in dessen Gegenwart N-formyliertes Dipeptid nachgewiesen werden konnte. Diese Beobachtung legt es nahe, dass die Formylierung am N-Terminus des linearen Gramicidins für dessen Bioaktivität als dimerer Ionenkanal, der sich in die bakterielle Zellmembran einlagert, von großer Bedeutung ist. Zum anderen wurde das bidomänale Enzym PCP-CTycC5-6 als Modellsystem für Untersuchungen der C-Domäne herangezogen. Dessen zuvor festgestellte unerwartete Fähigkeit, das an PCPTycC5 gebundene Hexapeptid DPhe-Pro-Phe-DPhe-Asn-Gln zu zyklisieren, wurde eingehender studiert. Mit Hilfe der MSn-Spektrometrie konnte die Kopf-zu-Schwanz-artige Konnektivität des zyklischen Produkts nachgewiesen werden. Die Substratspezifität dieser Reaktion wurde darüber hinaus anhand sechs weiterer Oligopeptide untersucht, von denen drei vom Enzym umgesetzt wurden. Desweiteren wurden Mutationsstudien durchgeführt, um die Gültigkeit bestehender Katalysemodelle für die C-Domäne zu prüfen. Nach einem dieser Modelle spielt ein konservierter Histidinrest eine entscheidende Rolle als Base bei der C-Domänenkatalyse. Obgleich die produzierten Alanin- und Valinmutanten dieses Aminosäurerestes zu korrekt gefalteten Proteinen führten, war doch deren Fähigkeit, Oligopeptide zu zyklisieren, verloren gegangen. Durch Kristallisationsexperimente mit dem Wildtyp-Enzym apo-PCP-CTycC5-6 konnte eine viel versprechende Bedingung gefunden werden, welche in Kollaboration mit der auf Kristallographie spezialisierten Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Essen (Marburg) optimiert wurde. Es gelang, die erste Kristallstrukur eines bidomänalen nichtribosomalen Enzyms aufzuklären, wodurch bislang unbekannte Aspekte der Kommunikation zwischen einzelnen Domänen beleuchtet werden konnten. Die relative Anordnung der Domänen zueinander wurde als ein Zustand interpretiert, in dem apo-PCP eine Interaktion mit entweder anderen NRPS-Domänen oder einer Phosphopantethein-Transferase eingeht. Die hochvariable linker-Region, die beide Einheiten miteinander kovalent verknüpft, wurde erwartungsgemäß ohne Sekundärstruktur vorgefunden, obgleich schwache Wechselwirkungen mit den Oberflächen der beiden Domänen existieren. Kurioserweise findet sich ein vom verwendeten Puffer stammendes Sulfat-Ion in direkter Nähe zum vermuteten aktiven Zentrum der C-Domäne. In dieser Arbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass dieses tetraedrische Anion im Kristall deswegen fixiert ist, weil es dem Übergangszustand während der Kondensationsreaktion ähnelt. Als Konsequenz hieraus ergibt sich, dass die C-Domäne den Übergangszustand durch ihre elektrostatische Umgebung stabilisiert, anstatt die Reaktion durch chemische Basenkatalyse voranzutreiben.