Charakterisierung und Funktionsanalyse der Bindungsdomaene für den Kofaktor VP35 der RNA-Polymerase L des Ebola-Virus

Das Ebolavirus Zaire (EBOVz) zählt zu den tödlichsten humanpathogenen Erregern, gegen die es weder ein Therapeutikum noch einen Impfstoff gibt. Replikation und Transkription des 19 kb umfassenden negativsträngigen RNA-Genoms basieren auf der Bildung eines aktiven RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Komple...

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Main Author: Trunschke, Martina
Contributors: Renkawitz-Pohl, Renate (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2008
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Das Ebolavirus Zaire (EBOVz) zählt zu den tödlichsten humanpathogenen Erregern, gegen die es weder ein Therapeutikum noch einen Impfstoff gibt. Replikation und Transkription des 19 kb umfassenden negativsträngigen RNA-Genoms basieren auf der Bildung eines aktiven RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Komplexes, der sich aus einer katalytischen Untereinheit, der Polymerase L, und deren Kofaktor VP35 zusammensetzt. Dieser Komplex interagiert mit dem von Nukleoproteinen (NP) dicht umhüllten RNA-Genom, um so Replikation und Transkription zu katalysieren. Das L-Protein ist in diesem Prozess das Schlüsselenzym. In der vorliegenden Arbeit wurde die von der Interaktion der Untereinheiten L und VP35 abhängige Bildung des Polymerase-Komplexes untersucht. Dabei wurden mit Hilfe verschiedener L-Deletionsmutanten die Bindungsdomänen identifiziert, die das L-Protein zur Ausbildung der verschiedenen Komplexe benötigt. Darüber hinaus wurden diese L-Fragmente auf ihre Fähigkeit getestet, die Replikation und Transkription des EBOVz durch Blockade der VP35-L-Interaktion und/ oder der Homo-Oligomerisierung des L zu inhibieren. Ko-Expressionsstudien haben gezeigt, dass das L-Protein keine direkte Wechselwirkung mit dem NP eingeht. Das L-Protein interagiert jedoch mit VP35 und wird über dessen Bindung an NP zu der von NP umhüllten viralen RNA dirigiert. Mittels Immunfluoreszenz-Analysen und Ko-Immunpräzipitations-Assays konnte die VP35-Bindungsdomäne im N-terminalen Bereich des L-Proteins zwischen AS 280 bis 380 lokalisiert werden. Dieser Komplex wurde durch eine weitere Domäne des L-Proteins (AS 240-280) stabilisiert. Das L-Protein ist auch in der Lage Homo-Oligomere zu bilden. Die Homo-Oligomerisierung wird über die ersten 450 N-terminalen AS des L-Proteins vermittelt und konnte auch in Abwesenheit von VP35 nachgewiesen werden. Ferner wurden unter Verwendung eines Minigenom-Assays die inhibitorischen Effekte der L-Deletionsmutanten auf die Replikation und Transkription des EBOVz untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass N-terminale L-Fragmente, die mindestens 380 AS umfassen und die intakte VP35-Bindungsdomäne enthalten, zur effizienten Hemmung der Replikation und Transkription des EBOVz-Minigenoms fähig waren. Dies weist darauf hin, dass die Polymeraseaktivität durch eine kompetitive Hemmung der VP35-L-Komplexbildung inhibiert werden kann. Abschließend kann festgestellt werden, dass der N-terminale Bereich des L-Proteins sowohl die VP35-Bindungsdomäne als auch die Homo-Oligomerisierungsdomäne enthält und damit eine wichtige Funktion in der Bildung des aktiven Polymerase-Komplexes einnimmt. Aus diesem Grund ist diese Domäne ein viel versprechender potentieller Angriffspunkt für die Entwicklung antiviraler Komponenten.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2008.0067