ths Prof. Daut Jürgen Daut, Jürgen (Prof.) 2007-10-29 doctoralThesis Intracellular Ca2+ is an important regulator of diverse functions of macrophages. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) is the major Ca2+ influx pathway of human macrophages. Ca2+ activated potassium channels of the KCa3.1 subtype (IKCa channels) are expressed in human macrophages. We hypothesized that IKCa may be activated by store-operated Ca2+ entry and that .the resulting hyperpolarization may serve to sustain the Ca2+ influx through store-operated channels (SOCs). Human macrophages were differentiated from peripheral blood mononuclear cells and had the typical morphological properties and expressed the macrophage marker CD14. The calcium stores were depleted in Ca2+-free solution by activation of P2Y purinergic receptors with UTP or by application of the calcium pump inhibitor thapsigargin. Current-clamp experiments showed that re-addition of Ca2+ to the bath solution resulted in membrane hyperpolarization. This hyperpolarization was inhibited by IKCa blocker charybdotoxin (CHTX) and by the SOC blocker 2-APB. Whole-cell patch clamp at 0 mV showed that SOCE induced an outward current which was also blocked by CHTX and 2-APB. These data indicate that IKCa channels are the dominant KCa channels in human macrophages and can be activated by SOCE, which results in hyperpolarization of macrophages. By using cesium-based pipette solution, we recorded the inward current carried by calcium-release-activated channels (ICRAC) after depletion of the intracellular calcium stores with the calcium buffer EGTA, with the purinergic agonist UTP or the Ca2+-pump blocker thapsigargin. ICRAC had a reversal potential ]+50 mV and could be blocked by 2-APB. Fluoro¬metric measurements of intra¬cellu¬lar free Ca2+ with fluo-3 showed that UTP or thapsigargin induced a transient increase of intracellular Ca2+ in Ca2+ free solution, which was followed by a sustained Ca2+ influx after re-addition of Ca2+ to bath solution. Blockage of IKCa with CHTX resulted in accelerated decay of Ca2+ fluorescence but had no effects on initial rate of Ca2+ influx. These findings suggest that Ca2+ influx activates IKCa and hyperpolarizes the membrane potential, which will maintain the driving force for Ca2+ influx by providing counter ions for Ca2+ -influx through store-operated channels. Very recent studies have shown that protein Orai1, 2, 3 may be the molecular candidates of ICRAC and that the protein STIM1 may represent the sensor of ER Ca2+ content. Using RT-PCR, we found that Orai1, Orai 2, Orai3 and STIM1 were expressed by human macrophages. These results suggest that one or more members of Orai protein family may form the store-operated Ca2+ entry pathway in human macrophages and that STIM1 may act as a Ca2+ sensor. Our data indicate that IKCa channels and SOCE may provide a feedback loop for Ca2+ influx, The sustained Ca2+ influx is important for proper function of immune system. monograph 106 application/pdf Store-operated calcium channel 2007 Gao,Yadong Store-operated Kalziumkanale Kalziumaktiviete Kaliumkanale 2007-10-23 https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2007/0714/cover.png 2011-08-10 Macrophages Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg Intrazelluläres Ca2+ ist ein wichtiger Regulator für vielfältige Funktionen von Makrophagen. Speicherregulierter Ca2+ Einstrom (SOCE) ist die Hauptkomponente des Ca2+ Einstroms in menschlichen Makrophagen. Ca2+ aktivierte Kaliumkanäle der KCa3.1 Untergruppe (IKCa Kanäle) sind in menschlichen Makrophagen exprimiert. Wir stellen die Hypothese auf, daß IKCa durch speicherregulierten Ca2+ Einstrom aktiviert wird und daß die daraus resultierende Hyperpolarisation hilft, den Ca2+ Einstrom durch speicherregulierte Ca2+ Kanäle aufrecht zu erhalten. Menschliche Makrophagen wurden aus peripheren mononuclearen Blutzellen gewonnen und hatten deren typische morphologische Eigenschaften. Sie expremierten den Makrophagenmarker CD14. Die Calziumspeicher wurden in Ca2+-freier Lösung durch Aktivierung von purinergen P2Y Rezeptoren mit UTP oder durch Zugabe des Calziumpumpenblockers Thapsigargin entleert. Messungen im Stromklemmmodus zeigten bei Wiederzugabe von Ca+2 in die Badlösung eine Hyperpolarisation. Diese Hyperpolarisation wurde durch Zugabe des IKCa Blockers Charybdotoxin (CHTX) und durch den SOCE Blocker 2-APB verhindert. Ganzzell Patchclamp Messungen bei 0 mV zeigten daß SOCE einen Auswärtsstrom induziert, der durch CHTX und 2-APB blockiert wurde. Diese Daten deuten darauf hin, daß IKCa Kanäle die bedeutendsten KCa Kanäle in Makrophagen sind und durch SOCE aktiviert werden können. Diese Aktivierung führt zu einer Hyperpolarisation der Makrophagen. Unter Verwendung einer Cäsium basierten Pipettenlösung maßen wir den Einwärtsstrom, der durch die „calcium release activated channels“ (ICRAC) getragen wird, nachdem die intrazellulären Calziumspeicher mit dem Calziumpuffer EGTA, den purinergen Aktivator der P2Y Rezeptoren UTP oder dem Calziumpumpenblocker Thapsigargin entleert wurden. ICRAC besaß ein Umkehrpotential von ]+50 mV und konnte durch 2-APB blockiert werden. Fluoreszensmessungen von intrazellulärem freien Ca2+ mit Fluo-3 zeigten, daß UTP und Thapsigargin zu einem transienten Anstieg von intrazellulärem Ca2+ bei Ca2+ freier Badlösung führt. Bei folgender Ca2+ Zugabe zur Badlösung folgt ein lang anhaltender Ca2+ Einstrom. Der Block von IKCa mit CHTX führte zu einer schnelleren Abnahme der Ca2+ abhängigen Fluoreszens, hatte aber keinen Einfluß auf die anfängliche Höhe des Ca2+ Einstroms. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß der Ca2+ Einstrom den IKCa aktiviert und dadurch zu einer Hyperpolarisation der Membran führt was die treibende Kraft für den Ca2+ Einstrom aufrecht erhält indem eine Gegenladung für den Ca2+ Einstrom durch speicherregulierte Ca2+ Kanäle bereitgestellt wird. Ganz neue Studien haben gezeigt, daß die Proteine Orail1, 2 und 3 gute Kandidaten für die Träger des ICARC sind und daß STIM1 der Ca2+ Sensor im ER ist. Mittels RT-PCR konnten wir die Expression von Orai1, Orai2, Orai3 und STIM1 in menschlichen Makrophagen nachweisen. Diese Resultate legen nahe, daß ein oder mehrere Mitglieder der Orai Proteine den speicherregulierten Ca2+ Einstromkanal in menschlichen Makrophagen bilden und daß STIM1 als Ca2+ Sensor dient. Unsere Daten weisen darauf hin, daß IKCa Kanäle und SOCE einen Regelkreis für den Ca2+ Einstrom bilden. Der anhaltende Ca2+ Einstrom ist für die Funktion unseres Immunsystems notwendig. opus:1799 The role of calcium-activated potassium channels and store-operated calcium channels in human macrophages English Store-operated Kalziumkanale Makrophagen Kalziumaktiviete Kaliumkanale Medical sciences Medicine Medizin https://doi.org/10.17192/z2007.0714 Makrophagen Medizin Die Role der kalziumaktivierter kaliumkanale und store-operated Kalziumkanale in menschlichen Makrophagen Calcium activated potassium channel urn:nbn:de:hebis:04-z2007-07147 Philipps-Universität Marburg Normale und Pathologische Physiologie