Sanfilippo C https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2007/0581/cover.png German Die Acetyl-CoA-Glucosaminid-N-Acetyltransferase ist ein lysosomales Protein, dessen Ausfall das Sanfilippo C-Syndrom (Mukopolysaccharidose Typ IIIC, OMIM 252930) bedingt. Dabei handelt es sich um eine von elf durch distinkte Enzymdefekte bedingten Mukopolysaccharidosen. Durch den Ausfall der lysosomalen Acetyltransferase kommt es zu einer Störung des Heparansulfatabbaus mit einer Ansammlung von Stoffwechselprodukten im Lysosom. Die zugrunde liegende Gensequenz wurde 2006 von Fan et al. und Hrebicek et al. beschrieben. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war eine Anreicherung und Solubilisierung der lysosomalen Acetyltransferase. Das Enzym wurde aus humaner Plazenta gewonnen. Nach einer Anreicherung lysosomaler Membranproteine durch Immunaffinitätsabsorption wurden die Membranen mit Detergentien solubilisiert und die extrahierten Membranproteine durch verschiedene Verfahren fraktioniert. Hierzu wurden die Extraktionsbedingungen optimiert sowie Gelfilration und Ionenaustauscherchromatographie verwendet. In den so gewonnenen Fraktionen wurde die Aktivität von Acetyltransferase bestimmt und die Fraktionen höchster Aktivität durch SDS-PAGE und 2D-Elektrofokussierung/SDS-PAGE weiter charakterisiert. Eine Isolierung markierter Acetyltransferase konnte wegen eines im Rahmen der zweidimensionalen Trennung aufgetretenen Verlusts des markierten Proteins nicht erreicht werden. Es zeigte sich jedoch, dass die Markierung wenig spezifisch war. Nach eindimensionaler Trennung wurde in dem als wahrscheinlich für die Acetyltransferase geltenden Molekulargewichtsbereichen die alkalische Phosphatase identifiziert. Auf Grund der vorliegenden Ergebnisse erscheint die Hypothese von Bame und Rome (1986) über Bildung eines acetylierten Enzymintermediats als wenig wahrscheinlich. Durch uns konnte erstmals die Assoziation der Acetyltransferase zu rafts gezeigt werden. Versuche mit -Cyclodextrin zeigten, dass die optimale Aktivität der Acetyltransferase von der Anwesenheit von Cholesterin, einem typischen Bestandteil von DRMs (detergent resistant membranes) abhängig ist. Die hier beschriebenen Trennmethoden und Solubilisierung und die erstbeschriebene Bedeutung von Cholesterin für die Aktivität der Acetyltransferase können eine Grundlage künftiger Isolierung und Rekonstitution des Membranproteins in Liposomen werden. Lysosome Untersuchung lysosomaler Membranproteine mit dem Schwerpunkt der Charakterisierung der Acetyl-Coenzym A: a-Glucosaminid N-Acetyltransferase aus lysosomalen Membranpräparationen aus humaner Plazenta 143 application/pdf Mucopolysaccharidosis III C monograph Placenta Acetyl-CoA-Glucosaminid-N-Acetyltransferase is a lysosomal protein whose deficiency causes the Sanfilippo C-syndrome (mucopolysaccharidosis type III C, OMIM 252930). This is one out of eleven mucopolysaccharidoses caused by distinct enzyme-deficiencies. The missing enzyme function causes defective heparansulfate degradation leading to accumulation of undegraded material in the lysosome. The underlying gene sequence was described by Fan et al and Hrebicek et al in 2006. One major aim in this work war enrichment and solubilisation of the lysosomal acetyltransferase. The enzyme was isolated from human placenta. After enrichment of lysosomal membrane proteins by immunoaffinity absorption the membranes were solubilized and the extracted membrane proteins fractioned by various methods. The extraction methods were optimised and gelfiltration as well as ionexchange chromatography were used. In the hereby gained fractions the activity of acetyltransferase was measured and the fractions containing the highest amount of activity were subjected to further characterization using SDS-PAGE and 2D-electrofocussing/SDS-PAGE. An isolation of radioactive labelled acetyltransferase was not successful due to the loss of the labelling during the separation process. Later it was shown that the labelling also appeared not to be very specific. After one dimensional separation in SDS-PAGE we detected alkaline phosphatase in the possible Acetyltransferase containing regions (according molecular weight). We could demonstrate for the first time the association of acetyltransferase to rafts. Experiments with beta-cyclodextrin showed that the activity of acetyltransferase is dependent on cholesterol, a typical part of detergent resistant membrane domains. The in this work described solubilisation and fractioning methods as well as the first described role of cholesterol for the activity of Acetyltransferase could provide a ground for further isolation and reconstitution of the membrane protein in liposomes. urn:nbn:de:hebis:04-z2007-05817 2011-08-10 TMEM76 Stoffwechselerkrankung Medical sciences Medicine Medizin opus:1758 2007 Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg Physiologische Chemie Lysosom Biochemical and biophysical research communications 2002, 198:5-9 Acetyltransferase Aufreinigung Membran Characterization of lysosomal membrane proteins with emphasis on acetyl-coenzyme A: a-glucosaminid N-acetyltransferase of lysosomal membrane preparation of human placenta 2007-09-20 https://doi.org/10.17192/z2007.0581 Membrane protein ths Prof. Hasilik Andrej Hasilik, Andrej (Prof.) Wätzig, Kristin Irene Wätzig Kristin Irene Medizin Plazenta 2D-SDS-PAGE Philipps-Universität Marburg doctoralThesis 2007-08-21