Zugkraftanalyse an Osteoblasten nach mechanischer Stimulation

Der Knochen ist in der Lage, sich veränderten mechanischen Bedingungen anzupassen. Bei verminderter Belastung stehen degenerative Prozesse im Vordergrund, bei erhöhter Belastung kommt es zu einer Zunahme der Knochensteifigkeit. Die zellulären Prozesse, die der Wahrnehmung von mechanischen Stimuli un...

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Main Author: Lautenschläger, Tim
Contributors: Jones, David B. (Prof.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2007
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Der Knochen ist in der Lage, sich veränderten mechanischen Bedingungen anzupassen. Bei verminderter Belastung stehen degenerative Prozesse im Vordergrund, bei erhöhter Belastung kommt es zu einer Zunahme der Knochensteifigkeit. Die zellulären Prozesse, die der Wahrnehmung von mechanischen Stimuli und einer veränderten mechanischen Umgebung zu Grunde liegen, sind erst teilweise bekannt. Es gibt wenig Hinweise inwiefern Zellen ihre eigene Umgebung mechanisch mitgestalten oder unter welchen Bedingungen Zellen wie auf mechanische Stimulation reagieren. Im besonderen stellte sich die Frage, ob Zellen auf mechanische Stimulation mit einer mechanischen Antwort reagieren. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktionskräfte von Osteoblasten mit ihrer Umgebung nach mechanischer Stimulation zu charakterisieren. Die Zugkraftmikroskopie ermöglicht es diese Kräfte zu messen. Dazu werden Zellen auf Kollagen-beschichteten weichen Polyacrylamidgelen mit darin enthaltenen Fluoreszenzmarkern ausgesät. Die Zelle verformt das unter ihr liegende weiche Substrat und dabei verschieben sich die darin enthaltenen Fluoreszenzmarker. Diese Verschiebungen dienen als Ausgangspunkt für die Berechnungen der Zugkräfte. In dieser Arbeit werden Zugkräfte von Osteoblasten nach zwei verschiedenen Arten der mechanischen Stimulation bestimmt. Zur Applikation von vertikalen Kompressionsreizen auf einzelne Zellen wurde ein Kraftmikroskop, das nach den Prinzipien der Rasterkraftmikroskopie funktioniert, verwendet. Mittels einer Dehnungsmaschine wurden Zellkulturen gleichmäßig uniaxial gedehnt. Für Dehnungsversuche musste dazu die Methode der Zugkraftmikroskopie den veränderten Gegebenheiten angepasst werden. Im Experiment wird eine Zellpopulation auf einem physiologisch weichen Untergrund zyklisch gedehnt (20 Zyklen, 10 Hz, 0,6%) und die Zugkräfte einer einzelnen Zelle quantitativ über die Zeit bestimmt. In einer zweiten Versuchsreihe wurden Zellen mit dem Kraftmikroskop vertikal komprimiert (20 Zyklen, 10 Hz, 300 nN) und die Zugkräfte im zeitlichen Verlauf beobachtet. Ein Großteil der zyklisch stimulierten Zellen (22/28) weist signifikante Änderungen in den Zugkräften vor und nach Stimulation auf. Standardisiert man die Zugkräfte vor und nach Stimulation, findet man für beide Versuchsreihen eine Erhöhung der Zugkräfte um über 100%, wobei sich die absoluten Zugkräfte vor und nach Stimulation aber nicht unterscheiden. Osteoblasten reagieren also auf mechanische Stimulationen auch mit einer mechanischen Antwort. Neben den schnellen Zugkraftänderungen konnte nach beiden Arten der zyklischen mechanischen Stimulation nach Stimulation mit dem Kraftmikroskop bei einem Viertel der stimulierten Zellen eine langsame stetige Erhöhung oder Verminderung der Zugkräfte über mehrere Minuten beobachtet werden. Nach Dehnungsstimulation ist bei solchen Zellen, die nach Stimulation erhöhte Zugkräfte aufweisen, eine hohe Varianz der Zugkräfte auffällig. Osteoblasten reagieren also nicht uniform auf alle Arten der mechanischen Stimulation. Dies könnte durch Aktivierung von verschiedenen Signalwegen oder durch Aktivierung unterschiedlicher Mechanosensoren erklärt werden. Nach nicht-zyklischer Stimulation mit dem Kraftmikroskop wurden dagegen nur langsame Änderungen der Zugkräfte beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Frequenz einer mechanischen Stimulation auch eine wichtige Rolle auf zellulärem Niveau spielt. Nach Dehnungsstimulation traten die stärksten Änderungen der Zugkräfte direkt nach Dehnung auf - meist innerhalb von fünf Sekunden. Calciumaktivierungen und Aktivierung der Erk1/2 MAPKn werden aber erst nach einer Verzögerung von über einer Minute beobachtet. Nach Stimulation mit dem Kraftmikroskop konnten keine physiologischen Calciumaktivierungen beobachtet werden, obwohl Zugkraftänderungen bereits direkt nach Stimulation zu beobachten waren. Die hier gewonnenen Ergebnisse zeigen im Kontext, dass erste Zugkraftänderungen nach mechanischer Stimulation unabhängig von einer ganz-zellulären Calciumaktivierung auftreten. Die hier vorliegende Arbeit gewährt tiefere Einblicke in das zellmechanische Verhalten unter äußerer Belastung. Durch die Anpassung und Etablierung der Zugkraftmikroskopie für mechanische Stimulationsexperimente steht nun ein vielseitiges Instrument zur Verfügung, um Änderungen der zellulären Interaktionskräfte mit ihrer Umgebung nach mechanischer Stimulation genauer zu untersuchen. Auf den hier vorgestellten Ergebnissen aufbauend, wird man daran arbeiten, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieser Kraftänderungen aufzuklären.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2007.0177