Aktivitätsverhalten von ERK1 und 2 in MG-63 Osteosarkomzellen unter dem Einfluß von Inhibitoren bei mechanischer Belastung

Fast alle Zellen reagieren auf mechanische Reize mit elektrophysiologischer und/ oder biochemischer Antwort. Versuche haben gezeigt, dass außer MG-63 Osteosarkomzellen auch andere Osteosarkomzellinien oder Zellen wie Osteoblasten, Chondrozyten, Endothelzellen und Herzmuskelzellen auf mechanische Deh...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Main Author: Westrich, Cornelia
Contributors: Jones, David (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2007
Orthopädie und Rheumatologie
Subjects:
PKC
ERK
Online Access:PDF Full Text
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Description
Summary:Fast alle Zellen reagieren auf mechanische Reize mit elektrophysiologischer und/ oder biochemischer Antwort. Versuche haben gezeigt, dass außer MG-63 Osteosarkomzellen auch andere Osteosarkomzellinien oder Zellen wie Osteoblasten, Chondrozyten, Endothelzellen und Herzmuskelzellen auf mechanische Dehnung mit einer ERK1 und 2-Aktivierung reagieren. Durch Mechanotransduktion wurde die Signalkaskade der humanen MG-63 Osteosarkomzellen näher untersucht. Durch in die Signalkaskade eingreifenden Inhibitoren wie BAPTA AM (Calcium-Komplexbilder), Gö 6976 (Inhibitor der calciumabhängigen PKC bei den hier verwendeten Konzentrationen) und Gö 6983 (Inhibitor der PKC außer der µ-Isoform bei den hier verwendeten Konzentrationen) und mechanischer Dehnung der MG-63 Osteosarkomzellen soll das Aktivitätsverhalten von ERK1 und 2 untersucht und dabei herausgefunden werden, welche Isoform der PKC an der Signalkaskade beteiligt ist. Durch einen MTT-Zellproliferationsassay hat sich bei der 5. Zellpassage durch Dehnung der Zellen um 4000µstr mit 1Hz und 30 Zyklen eine vermehrte Stoffwechselaktivität und damit eine gesteigerte Zellproliferation um 28,48% gezeigt. Es wurden drei verschiedene Versuchsreihen durchgeführt, wobei bei den Dehnungsversuchen die Zellen um 4000µstr mit 1Hz und 30 Zyklen gedehnt wurden. Die Zellen wurden nach der Dehnung unterschiedlich lange von 30sec bis 15 Minuten inkubiert. In einer anderen Versuchsdurchführung wurden die Zellen nur mit den Inhibitoren BAPTA AM, Gö 6976 und Gö 6983 behandelt. In einer weiteren Versuchsreihe wurden die Zellen vor der Dehnung mit den oben genannten Inhibitoren behandelt. Nach der jeweiligen Versuchsdurchführung wurden die Zellen lysiert und jeweils 50µg Zellprotein-Gemisch der einzelnen Zellproben durch Elektrophorese aufgetrennt. Durch einen Western-Blot wurden dann die Proteinbanden auf eine PVDF-Membran transferiert und anschließend durch einen colorimetrischen Nachweis mit einem Primär-, Sekundärantikörper und einer an den Sekundärantikörper gekoppelten alkalischen Phosphatase durch Farbreaktion sichtbar gemacht. Durch alleinige Dehnung der Zellen zeigte sich je nach der ERK1 und 2-Grundaktivität eine Aktivierung oder Herunterregulierung der ERK1 und 2. Bei der 3.und 12. Zellpassage mit niedriger ERK1 und 2-Grundaktivität zeigte sich eine ERK1 und 2-Aktivierung mit einem Maximum nach einer Inkubationszeit von 1min nach der Dehnung bei der 3. Zellpassage und einem Maximum erst nach 15min bei der 12. Zellpassage. Wegen schneller (1min) und langsamer (15min) Signaltransduktionszeit werden sowohl calciumabhängige und calciumunabhängige Signalkaskaden vermutet. Überraschenderweise zeigte sich bei der 9. Zellpassage eine Herunterregulierung der ERK1 und 2-Aktivität mit einem Minimum nach 2-minütiger Inkubationszeit nach der Dehnung. Durch Behandlung der Zellen mit den oben genannten Inhibitoren zeigte sich eine paradoxe Aktivierung der ERK1 und 2. Eine paradoxe Aktivierung wurde bereits im humanen THP-1 Zellen durch Inhibition von c-Raf und in humanen HL60-Leukämiezellen durch Inhibition der p38MAPK nachgewiesen. Eine paradoxe Aktivierung erfolgt auf zwei verschiedenen Wegen. Durch Inhibition der PKC oder hiernach auch Calcium kommt es kompensatorisch zu einer Aktivierung eines übergeordneten Signalproteins, durch welches letztendlich ERK1 und 2 aktiviert werden. Andererseits wird durch Inhibition der PKC der negative Feedback-Mechanismus der PKC durchbrochen und damit die Autoinhibition der PKC unterdrückt, was eine Aktivierung der PKC zur Folge hat und letztendlich eine ERK1 und 2-Aktivierung bewirkt. Zellen der 6. Passage zeigten durch Behandlung mit Gö 6983 vor der Dehnung, dass die Dehnung zwar auch eine Aktivierung der ERK1 und 2 bewirkt, aber die Aktivierung bei steigenden Konzentrationen von Gö 6983 abnimmt. Dagegen zeigte sich bei der 9. Passage ein umgekehrtes Bild der Aktivierung mit einer Zunahme bei steigenden Konzentrationen.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2007.0002