Characterization of Binding Pocket Flexibility of Aldose Reductase

Aldose Reductase (AR) is the ist das erste Enzym des „Sorbitol-Stoffwechselweges“. Es reduziert unter Verbrauch von NADPH als Kofaktor verschiedene Aldehyde zu den entsprechenden Alkoholen. Um diese Aufgabe effizient durchführen zu können, zeigt seine Bindetasche eine intrinsische Flexibilität. Diese geht im wesentlichen von einem kleinen Bereich der Bindetasche aus, dessen Bewegungen es erlauben, eine sog. „Spezifitätstasche“ zu öffnen oder zu schließen. Der erste Teil der Arbeit zeigt die Auswirkungen einer flexiblen Bindetasche auf die Zuverlässigkeit von Dockingexperimenten. Die Experimente wurden für zwei Moleküle durchgeführt, die ursprünglich für einen bestimmten Bindungsmodus entworfen wurden. Durch Docking in mehrere bekannte Bindetaschenkonformationen konnte gezeigt werden, dass der ursprünglich intendierte Bindungsmodus nicht als der energetisch günstigste vorausgesagt wurde. Diese Hypothese konnte durch die später erhaltenen Kristallstrukturen der jeweiligen Komplexe bestätigt werden. Trotz dieser guten Ergebnisse, waren die Vorhersagen nicht zufriedenstellend. Der Bindungsmodus des einen Moleküls ist inkompatibel mit allen bekannten Bindetaschekonformationen, daher stand für eine bessere Vorhersage kein geeignetes Templat zur Verfügung. Beim experimentell bestimmten Bindungsmodus des zweiten Moleküls spielt Wasser eine wichtige Rolle, dessen Wechselwirkungen beim Docken nur unzureichend berücksichtigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein kürzlich neu vorgestelltes Dockingverfahren im Zusammenhang mit Proteinflexibilität getestet. Hierbei handelt es sich um „in-situ cross-docking“. Anstatt Dockingexperimente in mehrere Bindetaschen sequentiell durchzuführen, werden bei diesem Verfahren multiple Proteinkonformationen simultan adressiert. Während des Dockings wird bei AutoDock das rigide Protein in Form eines Satzes von vorberechneten Energiegittern repräsentiert. Beim „in-situ cross-docking“ werden mehrere Gittersätze aneinander gereiht und somit eine Art „Super-Gitter“ erzeugt. Der nächste Teil dieser Arbeit untersucht detailliert das Ausmaß der Flexibilität der einzelnen Aminosäuren der AR Bindetasche. Es konnte gezeigt werden, dass lediglich einige wenige Aminosäuren für den Hauptteil der Anpassung an verschiedene Liganden verantwortlich sind. Zusätzlich wurde ein genauer Vergleich der Bindungsmoden verschiedener Liganden durchgeführt, die die Spezifitätstasche adressieren. Als Ergebnis konnte festgehalten werden, dass trotz großer Ähnlichkeiten zwischen den einzelnen Bindungsmoden, subtile Unterschiede festzustellen sind. Um den dem Enzym zugänglichen Konformationsraum weiter abzudecken, wurden ausgehend von den jeweiligen Kristallstrukturen zehn Molekulardynamik (MD) Simulationen durchgeführt. Dabei wurde eine gute generelle Übereinstimmung zwischen den Simulationen und der Kristallstrukturanalyse festgestellt. Dennoch verhielten sich einige Aminosäuren in den Simulationen anders, als nach der Analyse der Kristallstrukturen zu erwarten war: Phe 122, Trp 219 und Tyr 309. Diese wurden weitergehend untersucht. Ein weiterer Teil dieser Dissertation beschäftigt sich mit der Fragestellung, ob MD Simulationen genutzt werden können, um die an der „induced-fit“ Anpassung beteiligten Energien quantifizieren zu können. Zu diesem Zweck wurde die Methode MM-PBSA gewählt, welches die freie Bindungsenergie eines Komplexes aus MD Trajektorien berechnet, anstatt nur eine einzige Kristallstruktur dafür zu verwenden. Betrachtet man den enormen Zeit- und Rechenaufwand, so hat sich im Falle der AR MM-PBSA trotz intensiver Tests verschiedener Varianten als nicht zuverlässig herausgestellt. Im letzten Abschnitt dieser Arbeit wird eine zweiteilige Studie präsentiert. Der erste Teil beschäftigt sich mit mit einem weiteren Aspekt der Flexibilität des Bereiches, der für die „induced-fit“ Adaptionen verantwortlich ist. In einer kombinierten Studie aus MD Simulationen und mehreren Kristallstrukturen, konnte gezeigt werden, dass zwischen mehreren Strukturen des gleichen Protein-Ligand-Komplexes signifikante Unterschiede zu sehen waren. Eine exzellente Übereinstimmung zwischen den Befunden der Kristallstrukturen und den MD Simulationen wurde gefunden. Im zweiten Teil dieses Abschnittes geht es um die unerwartete Bindung mehrerer Ligandmoleküle in und in der Nähe der Bindetasche. Insgesamt vier Tolrestat-Moleküle konnten deutlich in der Elektronendichte lokalisiert werden. Die Bindung dieser zusätzlichen Liganden ging mit konformationellen Änderungen in weiten Teilen des Proteins einher, die in dieser Form vorher noch nicht beobachtet wurden. Insgesamt hat sich diese Arbeit am Beispiel der AR mit einer Reihe von Aspekten der Proteinflexibilität beschäftigt. Dabei hat sich AR als wertvolles Testsystem herausgestellt, um solche Phänomene mit unterschiedlichen Methoden zu untersuchen.