Charakterisierung der Typ I IFN-antagonistischen Eigenschaften des Influenza B Virus
Dauber, Bianca Helene
Im Rahmen dieser Arbeit konnte das NS1 Protein des Influenza B Virus als Antagonist der zellulären IFN-alpha/beta Antwort identifiziert werden. Die Grundlage dafür lieferte die erfolgreiche Konstruktion eines Plasmid-gestützten revers-genetischen Systems zur Herstellung rekombinanter Influenza B Viren. Der Vergleich des so generierten WT Influenza B/Lee Virus mit dem B/delNS1 Virus, dessen B/NS1 Leserahmen deletiert ist und das somit kein B/NS1 Protein exprimiert, brachte folgende Ergebnisse. (1) Die Anwesenheit des B/NS1 Proteins verhinderte die Induktion der IFN-alpha/beta Gene während einer Influenza B Virus Infektion, so dass in der Folge kein IFN-alpha/beta sezerniert wurde. (2) Die Inhibition der IFN-ß Induktion ließ sich darauf zurückführen, dass das B/NS1 Protein die Aktivierung des entscheidende Transkriptionsfaktors IRF-3 während der Infektion verhinderte. (3) Das B/NS1 Protein inhibiert darüber hinaus die Aktivierung der antiviralen dsRNA-abhängigen Proteinkinase R. (4) Der Verlust des B/NS1 Proteins führte zu einer sehr starken Attenuierung des B/delNS1 Virus in IFN-kompetenten Wirten. Die Summe dieser Eigenschaften demonstriert die Bedeutung des B/NS1 Proteins als entscheidende Determinante der biologischen Fitness von Influenza B Viren.
Zur Analyse der strukturellen und funktionellen Voraussetzungen für die IFN-antagonistische Funktion des B/NS1 Proteins wurden weitere Influenza B Viren mit Mutationen im B/NS1 Protein generiert. Die Charakterisierung der Virusmutanten zeigte, dass die dsRNA-Bindung durch das B/NS1 Protein nicht entscheidend für die Inhibition der IFN-alpha/beta Induktion ist. Der Verlust der C-terminalen Domäne des B/NS1 Proteins führte dagegen zu einer drastischen Reduktion der IFN-alpha/beta-inhibitorischen Funktion. Die Inhibition der IFN-alpha/beta Induktion durch das B/NS1 Protein scheint also nicht vornehmlich auf die Sequestrierung von dsRNA zurückzuführen zu sein, wie es für das IFN-antagonistische NS1 Protein der Influenza A Viren angenommen wird. Vielmehr deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Inhibition der IFN-alpha/beta Induktion durch Interaktionen der C-terminalen Domäne des B/NS1 Proteins mit dsRNA-Sensorproteinen, wie RIG-I und/oder mda-5, oder anderen Faktoren der IFN-alpha/beta induzierenden Signalkaskade vermittelt werden könnte.
Im Gegensatz zur IFN-alpha/beta Induktion zeigte sich eine direkte Korrelation von dsRNA-Bindungskapazität des B/NS1 Protein, Replikationsfähigkeit der Virusmutanten in IFN-kompetenten Wirten und Inhibition der PKR Aktivierung durch das B/NS1 Protein. Die Abhängigkeit der Replikation von der dsRNA-Bindungsfähigkeit des B/NS1 Proteins war zunächst ein überraschender Befund, da alle Virusmutanten nur schwach IFN-alpha/beta induziert hatten. Die Attenuierung der dsRNA-bindungsdefizienten Virusmutanten lässt sich jedoch durch die Aktivierung von PKR erklären, da PKR die zelluläre Translationsmaschinerie blockiert und damit auch die virale Replikation beeinträchtigen kann. Dem gegenüber steht die trotz starker IFN-alpha/beta Induktion gute Replikation des Influenza B Virus mit C-terminal trunkiertem B/NS1 Protein, da PKR hier nicht aktiviert wurde.
Diese Ergebnisse verdeutlichen den starken Einfluss der antiviralen Wirkung von PKR zur Kontrolle von Influenza B Virus Infektionen in den hier verwendeten Wirtssystemen. Es ist jedoch anzunehmen, dass eine hohe IFN-alpha/beta Sekretion die virale Replikation in Versuchstieren oder während einer natürlichen Infektion im Menschen deutlicher beeinflusst, da die immunmodulatorischen Wirkung von IFN-alpha/beta hier stärker zum tragen kommt. Die gezeigte Differenzierung der strukturellen Grundlagen für die Funktionen des B/NS1 Proteins bietet gute Voraussetzungen für die Entwicklung von Influenza B Viren als Lebend-Impfstoffe, die sowohl in ihrer Replikation eingeschränkt sind, als auch die Sekretion von IFN-alpha/beta zur Aktivierung der Immunantwort induzieren können.
Philipps-Universität Marburg
Medical sciences Medicine
https://doi.org/10.17192/z2006.0575
urn:nbn:de:hebis:04-z2006-05750
opus:1418
PKR
https://doi.org/10.17192/z2006.0575
PKR
Medizin
dsRNA
Charakterisierung der Typ I IFN-antagonistischen Eigenschaften des Influenza B Virus
Im Rahmen dieser Arbeit konnte das NS1 Protein des Influenza B Virus als Antagonist der zellulären IFN-alpha/beta Antwort identifiziert werden. Die Grundlage dafür lieferte die erfolgreiche Konstruktion eines Plasmid-gestützten revers-genetischen Systems zur Herstellung rekombinanter Influenza B Viren. Der Vergleich des so generierten WT Influenza B/Lee Virus mit dem B/delNS1 Virus, dessen B/NS1 Leserahmen deletiert ist und das somit kein B/NS1 Protein exprimiert, brachte folgende Ergebnisse. (1) Die Anwesenheit des B/NS1 Proteins verhinderte die Induktion der IFN-alpha/beta Gene während einer Influenza B Virus Infektion, so dass in der Folge kein IFN-alpha/beta sezerniert wurde. (2) Die Inhibition der IFN-ß Induktion ließ sich darauf zurückführen, dass das B/NS1 Protein die Aktivierung des entscheidende Transkriptionsfaktors IRF-3 während der Infektion verhinderte. (3) Das B/NS1 Protein inhibiert darüber hinaus die Aktivierung der antiviralen dsRNA-abhängigen Proteinkinase R. (4) Der Verlust des B/NS1 Proteins führte zu einer sehr starken Attenuierung des B/delNS1 Virus in IFN-kompetenten Wirten. Die Summe dieser Eigenschaften demonstriert die Bedeutung des B/NS1 Proteins als entscheidende Determinante der biologischen Fitness von Influenza B Viren.
Zur Analyse der strukturellen und funktionellen Voraussetzungen für die IFN-antagonistische Funktion des B/NS1 Proteins wurden weitere Influenza B Viren mit Mutationen im B/NS1 Protein generiert. Die Charakterisierung der Virusmutanten zeigte, dass die dsRNA-Bindung durch das B/NS1 Protein nicht entscheidend für die Inhibition der IFN-alpha/beta Induktion ist. Der Verlust der C-terminalen Domäne des B/NS1 Proteins führte dagegen zu einer drastischen Reduktion der IFN-alpha/beta-inhibitorischen Funktion. Die Inhibition der IFN-alpha/beta Induktion durch das B/NS1 Protein scheint also nicht vornehmlich auf die Sequestrierung von dsRNA zurückzuführen zu sein, wie es für das IFN-antagonistische NS1 Protein der Influenza A Viren angenommen wird. Vielmehr deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Inhibition der IFN-alpha/beta Induktion durch Interaktionen der C-terminalen Domäne des B/NS1 Proteins mit dsRNA-Sensorproteinen, wie RIG-I und/oder mda-5, oder anderen Faktoren der IFN-alpha/beta induzierenden Signalkaskade vermittelt werden könnte.
Im Gegensatz zur IFN-alpha/beta Induktion zeigte sich eine direkte Korrelation von dsRNA-Bindungskapazität des B/NS1 Protein, Replikationsfähigkeit der Virusmutanten in IFN-kompetenten Wirten und Inhibition der PKR Aktivierung durch das B/NS1 Protein. Die Abhängigkeit der Replikation von der dsRNA-Bindungsfähigkeit des B/NS1 Proteins war zunächst ein überraschender Befund, da alle Virusmutanten nur schwach IFN-alpha/beta induziert hatten. Die Attenuierung der dsRNA-bindungsdefizienten Virusmutanten lässt sich jedoch durch die Aktivierung von PKR erklären, da PKR die zelluläre Translationsmaschinerie blockiert und damit auch die virale Replikation beeinträchtigen kann. Dem gegenüber steht die trotz starker IFN-alpha/beta Induktion gute Replikation des Influenza B Virus mit C-terminal trunkiertem B/NS1 Protein, da PKR hier nicht aktiviert wurde.
Diese Ergebnisse verdeutlichen den starken Einfluss der antiviralen Wirkung von PKR zur Kontrolle von Influenza B Virus Infektionen in den hier verwendeten Wirtssystemen. Es ist jedoch anzunehmen, dass eine hohe IFN-alpha/beta Sekretion die virale Replikation in Versuchstieren oder während einer natürlichen Infektion im Menschen deutlicher beeinflusst, da die immunmodulatorischen Wirkung von IFN-alpha/beta hier stärker zum tragen kommt. Die gezeigte Differenzierung der strukturellen Grundlagen für die Funktionen des B/NS1 Proteins bietet gute Voraussetzungen für die Entwicklung von Influenza B Viren als Lebend-Impfstoffe, die sowohl in ihrer Replikation eingeschränkt sind, als auch die Sekretion von IFN-alpha/beta zur Aktivierung der Immunantwort induzieren können.
Expression of interferon (IFN)-alpha/beta in virus-infected vertebrate cells is a key event in the establishment of a sustained antiviral response, which is triggered by double-stranded (ds)RNA produced during viral replication. These antiviral cytokines initiate the expression of cellular proteins with activities that limit the replication and spread of the invading viruses. In this study we established and used a reverse genetic system for influenza B virus to demonstrate that the viral NS1 protein functions as the major viral IFN-antagonist and is necessary for efficient replication of influenza B virus. Characterization of the recombinant WT virus and the isogenic B/delNS1 virus that does not express the NS1 protein revealed that antagonization of the IFN-ß induction by the NS1 protein is due to its capacity to inhibit activation of the key transcription factor IRF-3. To test the postulate that the viral NS1 protein counteracts antiviral responses through sequestering intracellular dsRNA we analyzed a collection of recombinant influenza B viruses. As expected, viruses expressing dsRNA-binding defective NS1 proteins were strongly attenuated for replication in IFN-competent hosts, although they could effectively limit IFN induction. Interestingly, these virus mutants failed to prevent activation of the dsRNA-dependent protein kinase R (PKR), an important antiviral effector that can block the cellular translational machinery. Conversely, a mutant virus expressing the N-terminal dsRNA-binding domain of NS1 prevented PKR activation, but not IFN induction suggesting an important role of the NS1 C-terminal part for silencing the activation route of IFN-alpha/beta genes. Thus, our findings indicate an unexpected mechanistical dichotomy of the influenza B virus NS1 protein in the suppression of antiviral responses, which involves at least one activity that does not depend on dsRNA binding.
https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0575/cover.png
2006-09-08
dsRNA
Innate immunity
monograph
Influenza virus
Medical sciences Medicine
Medizin
147
application/pdf
doctoralThesis
Angeborene Immunitaet
2011-08-10
Philipps-Universität Marburg
2006
Interferon
urn:nbn:de:hebis:04-z2006-05750
ths
Dr.
Wolff
Thorsten
Wolff, Thorsten (Dr.)
German
Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg
Universitätsbibliothek Marburg
Characterization of the typ I IFN-antagonistic properties of the influenza B virus
Influenza Virus
Hygiene u. Med. Mikrobiologie mit Medizinaluntersuchungsamt
opus:1418
ppn:181065657
Dauber, Bianca Helene
Dauber
Bianca Helene
Interferon
2006-03-24
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