Characterization of mouse polycystic kidney disease and receptor for egg jelly gene and protein in heterologous and native system

The mammalian polycystic kidney disease (PKD) gene family comprises eight members whose role in cell physiology is still poorly understood. Two of the founding members of the family, PKD1 and PKD2, are responsible for the majority of cases of autosomal dominant polycystic kidney disease. While PKD1...

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Main Author: Butscheid, Yulia
Contributors: Gudermann, Thomas (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2006
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Die polycystic kidney disease (PKD)-Genfamilie besteht aus acht Genen, deren Rolle in der Zellphysiologie weiterhin zum größten Teil unklar ist. Die zwei zuerst entdeckten Mitglieder dieser Familie, PKD1 und PKD2, sind für die meisten Fälle der autosomal dominanten polyzystischen Nierenerkrankung verantwortlich. Während PKD1 ein zellmembranständiger Rezeptor zu sein scheint, handelt es sich bei PKD2 um einen Kationenkanal, welcher sowohl in der Zellmembran als auch intrazellulär beschrieben wurde. Die vorliegende Studie fokussiert auf polycystic kidney disease and receptor for egg jelly (PKDREJ), ein Protein welches sowohl einen großen rezeptorähnlichen extrazellulären Teil als auch einen mutmaßlichen Ionenkanal beinhaltet. Die Homologie von PKDREJ zu sea urchin receptor for egg jelly (suREJ)- Proteinen, welche wahrscheinlich eine Rolle in der Induktion der akrosomalen Reaktion von Spermatozoen bei Seeigeln spielen, gibt Anlass zu der Spekulation, dass PKDREJ die gleiche Funktion bei Säugetieren erfüllt. Obwohl das PKDREJ-Gen schon 1999 entdeckt wurde, sind seine Eigenschaften und Proteinmerkmale bislang weitestgehend unklar. Diese Studie untersucht das murine PKDREJ-Gen und -Protein und beschreibt erstmalig dessen Struktur, Expression und Lokalisation. Es wird gezeigt, dass PKDREJ stark in testikulärem Gewebe exprimiert wird und diese Expression auf Keimzellen und Spermatozoen beschränkt ist. Nach heterologer Expression in HEK 293-, COS7-, GC-1- und GC-2-Zellen sowie in Xenopus laevis-Eizellen verbleibt PKDREJ intrazellulär in endoplasmatischen Kompartimenten. Da viele bekannte Rezeptoren und Ionenkanäle, ohne spezielle Partner- oder „Adaptor“-Proteine nicht bestimmungsgemäß transportiert werden, wenn man sie in heterologen Systemen exprimiert, wurden Koexpressions-Experimente mit murinem HspA2, einem testisspezifischen Chaperon, PKD2L2, einem PKD2 eng verwandten Ionenkanal, und menschlichem PKD1 und PKD2 durchgeführt. In allen Fällen verblieb PKDREJ intrazellulär, unabhängig davon, ob mit oder ohne Koexpression anderer Proteine. Das Vorhandensein einer GPS-Domäne in der PKDREJ-Aminosäuresequenz gab Anlass, die proteolytische Spaltung in dieser Region zu untersuchen. Dabei charakterisiert diese Arbeit nicht nur biochemische Eigenschaften des PKDREJ-Proteins, sondern gibt auch erste Hinweise auf eine fehlende proteolytische Abspaltung der N-terminalen Proteindomäne. In HEK293-Zellen oder Xenopus laevis-Oozyten exprimiertes PKDREJ wird im Gegensatz zu PKD1 oder suREJ3 nicht in seiner GPS-Domäne gespalten. Außerdem wird eine Erklärung dieses Phänomens, basierend auf der Struktur der GPS-Domäne von PKDREJ und dem autokatalytischem Mechanismus der Spaltung, vorgeschlagen. Um das PKDREJ-Protein in einem nativen System zu untersuchen, wurden PKDREJ-spezifische polyklonale Antikörper entwickelt und charakterisiert. Durch indirekte Immunofluoreszenz war es möglich, PKDREJ in der akrosomalen Region und am inneren Anteil des sichelförmigen murinen Spermienkopfes zu lokalisieren. Zusätzliche Immun-Elektronenmikroskopie mit murinen Spermien zeigte die Lokalisation des PKDREJ-Proteins in der Plasmamembran und sicherte die vorausgesagte Protein-Topologie mit einem extrazellulär liegenden N-Terminus. Um die funktionelle Relevanz von PKDREJ in Hinblick auf die Induktion der akrosomalen Reaktion zu zeigen wurden kapazitierte murine Spermien mit Antikörpern gegen das N-terminale Ende von PKDREJ-Protein inkubiert. Wir konnten keinen antikörperinduzierten Ca2+-Einstrom oder eine signifikante Steigerung des Anteils akrosomreagierter Spermien beobachten. Des weiteren blockierten anti-PKDREJ Antikörper die Zona pellucida (ZP)-induzierte akrosomale Reaktion nicht. Diese Beobachtungen schließen eine Rolle von PKDREJ in der Akrosomreaktion nicht vollständig aus, da die Antikörper eventuell nicht in der Lage sind, eine aktive Proteinkonformation, eine Voraussetzung für die transmembranäre Signalkette, zu stabilisieren oder die relevanten Epitope, die für ZP-Signaltransduktion benötigt werden, zu blockieren. Dennoch könnte diese Arbeit der erste Hinweis einer anderen, noch unbekannten Funktion von PKDREJ in der Physiologie von Spermien sein. Obwohl die Mitglieder der PKD-Familie vielerorts exprimiert werden, galt PKDREJ bislang als hodenspezifisch. Wir konnten auf Proteinebene PKDREJ allerdings in Herzmuskelzellen und Lungenblutgefäßen nachweisen, wobei das Färbemuster von PKDREJ in beiden Zelltypen auf eine Lokalisation an den transversen Tubuli schließen lässt. Weitere nicht-testikuläre Expression wurde in Nierenepithelzellen und im Epididymis entdeckt. Im Nierenepithel war PKDREJ mit acetyliertem α-Tubilin kolokalisiert, einem Marker von primären Zilien. Diese Resultate bilden die Grundlage für weiterführende Untersuchungen zur Funktion und physiologischen Relevanz von PKDREJ.